Análisis comparativo de los niveles de expresión de fragmentos de anticuerpos recombinantes vNAR en Pichia pastoris y Escherichia coli
Los fragmentos de anticuerpo de dominio sencillo (~12 kDa), han mostrado ventajas sobre las moléculas de anticuerpo convencionales (~150 kDa) respecto a su aplicación clínica. La tecnología de ADN recombinante ha permitido la reducción al mínimo de los fragmento de anticuerpo que mantiene la afinida...
| Autor: | |
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| Formato: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2014 |
| País: | México |
| Recursos: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/546 |
| Acesso em linha: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/546 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | info:eu-repo/classification/Autor/Tumor Necrosis Factor Alpha,Antibody vNAR,Endotoxic shock,Anticuerpos vNAR,Factor de Necrosis Tumoral Alfa,Choque endotóxico,Escherichia coli,Pichia pastoris info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Resumo: | Los fragmentos de anticuerpo de dominio sencillo (~12 kDa), han mostrado ventajas sobre las moléculas de anticuerpo convencionales (~150 kDa) respecto a su aplicación clínica. La tecnología de ADN recombinante ha permitido la reducción al mínimo de los fragmento de anticuerpo que mantiene la afinidad parental de unión al antígeno. Un tipo distintivo de inmunoglobulina llamado IgNAR (nuevo receptor de antígeno) ha sido identificado en los peces cartilaginosos como los tiburones. Las IgNAR's carecen de cadenas ligeras y tienen la región de unión al antígeno comprendida en un solo dominio de cadena pesada denominado vNAR. Los dominios vNAR tienen características particulares como un tamaño pequeño (12-15 kDa), su CDR3 largo (13-23 residuos de aminoácidos), estabilidad térmica, estabilidad química y resistencia a pH gástrico. En el presente trabajo se compararon dos modelos de expresión (Escherichia coli y Pichia pastoris) con la finalidad de determinar cual sistema produce el mayor rendimiento del anticuerpo vNAR denominado T43. Este vNAR tiene la capacidad de neutralizar al Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFα), una citocina que al expresarse en altas concentraciones está implicada de manera negativa en algunas enfermedades inflamatorias agudas. Se utilizó la cepa Origami 2 (DE3) de E. coli, la cual posee mutaciones en los genes tiorredoxina reductasa (trxB) y glutatión reductasa (gor), lo que mejora considerablemente la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma y favorece el plegamiento de proteínas. A demás se empleó la cepa SMD1168 de P. pastoris, que es deficiente de proteasas A. Previo a la expresión, se optimizaron las condiciones de inducción de la expresión del vNAR T43 en los dos microorganismos. Los rendimientos obtenidos fueron de 4.66 mg/L para P. pastoris, mientras que para E. coli se evaluaron dos vectores, el pET101/D y pComb3x que presentaron rendimientos de 0.90 mg/L y 0.27 mg/L respectivamente. Para verificar la capacidad de neutralización in vivo del efecto de TNFa por el vNAR T43 producido en ambos modelos de expresión, se empleó un modelo de choque endotóxico en ratones Balb/c. Existe un aumento en la supervivencia de al menos 12 horas en los ratones tratados con los anticuerpos vNAR respecto al control sin tratamiento. No se encontró diferencia entre la actividad del vNAR T43 expresado en la cepa SMD1168 de P. pastoris y la cepa Origami 2 (DE3) de E. coli. Estos resultados sugieren que los dos modelos de expresión empleados son capaces de producir el vNAR T43 de forma activa y funcional, siendo P. pastoris el modelo que proporciona el mayor rendimiento de expresión (hasta cinco veces mayor que el de E. coli). |
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