Desarrollo de un anticuerpo tipo vNAR fluorescente para uso en microscopía de fluorescencia
En esta tesis se presenta un estudio para probar el uso de un vNAR de Heterodontus francisci, funcionalizado con un fluorocromo en aplicaciones de microscopía de fluorescencia para proteínas del microtúbulo. La microscopía de fluorescencia es una técnica esencial en la investigación biológica. Una d...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2023 |
| País: | México |
| Recursos: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/3851 |
| Acesso em linha: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3851 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | info:eu-repo/classification/Autor/microscopía de fluorescencia, vNAR, IgG, tubulina info:eu-repo/classification/Autor/Fluorescence microscopy, vNAR, IgG, tubulin info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/23 info:eu-repo/classification/cti/2301 info:eu-repo/classification/cti/230112 |
| Resumo: | En esta tesis se presenta un estudio para probar el uso de un vNAR de Heterodontus francisci, funcionalizado con un fluorocromo en aplicaciones de microscopía de fluorescencia para proteínas del microtúbulo. La microscopía de fluorescencia es una técnica esencial en la investigación biológica. Una de sus limitaciones es la poca variedad de moléculas disponibles para implementarla. Entre las estrategias exploradas se encuentra el uso de anticuerpos (IgG) fluorescentes, lo que permite tener una gran especificidad de detección de proteínas o moléculas. Con el fin de ampliar el repertorio de moléculas disponibles para hacer la técnica de microscopía de fluoresencia, se propuso utilizar un vNAR, que es un fragmento de un anticuerpo de tiburón (IgNAR), de tamaño 10 veces menor que el anticuerpo convencional, pero que conserva la especificidad por los antígenos. Con este planteamiento se espera que al utilizar un vNAR permita estudiar proteínas como las del microtúbulo o proteínas ≤50 kDa de igual manera que la IgG normal. Para lograrlo, se realizó el aislamiento de un vNAR (anti-α y β-tubulina) y se funcionalizó con un fluorocromo. La metodología comenzó con una bioselección mediante despliegue en fagos a partir de bibliotecas sintéticas. El protocolo optimizado para la obtención del vNAR comenzó con la inducción de las proteínas con IPTG en un cultivo de bacterias E. coli BL21, posteriormente un proceso de extracción de proteínas por choque osmótico o con ultrasonido, seguido de una ronda de purificación del lisado y repurificación de las fracciones por HisTrap FF. La detección del vNAR se realizó con electroforesis SDS-PAGE, Western Blot, ELISA y anticuerpos anti HA-HRP. Los vNARs obtenidos se conjugaron con el fluorocromo 660 C de la línea CF NHS. Posteriormente, se realizó microscopía de fluorescencia en fibroblastos humanos y se tomaron micrografías de las células con los microtúbulos marcados, además, se analizó la imagen con el programa FIJI. Finalmente, se logró aislar el vNAR ATH14, conjugarlo con el fluorocromo y hacer ensayos de microscopía de fluorescencia con un vNAR, sin embargo, no fue posible observar microtúbulos muy definidos. |
|---|