Expresión y purificación de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante nativa (rCHH-AN) y su participación en osmorregulación en Litopenaeus vannamei
La Hormona Hiperglucémica de Crustáceos (CHH) es la hormona más abundante producida en el órgano X-Glándula del seno, el principal centro neuroendócrino en crustáceos. La expresión de proteínas recombinantes en organismos como Pichia pastoris ha permitido obtener grandes cantidades de hormonas impli...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2014 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/636 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/636 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/Autor/Hormona (CHH), neurohormona CHH-A info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Sumario: | La Hormona Hiperglucémica de Crustáceos (CHH) es la hormona más abundante producida en el órgano X-Glándula del seno, el principal centro neuroendócrino en crustáceos. La expresión de proteínas recombinantes en organismos como Pichia pastoris ha permitido obtener grandes cantidades de hormonas implicadas en los procesos endocrinos y fisiológicos. En el presente trabajo, se evaluó la expresión de la neurohormona CHH-A recombinante nativa (rCHH-AN) de Litopenaeus vannamei a partir de dos cepas metilotróficas de P. pastoris, que contienen insertado en su genoma la secuencia que codifica para el péptido maduro de CHH-A (SMD1168H-CHHAN y X-33CHHAN). Dos medios de cultivo (complejo y mínimo) fueron evaluados por 4 días, inducidos con diferentes concentraciones de metanol (0, 1, 2 y 4%). La mejor condición de expresión se obtuvo con la cepa X-33-CHHAN, con el medio de cultivo complejo inducido con 2% de metanol por 24 horas. La hormona producida fue analizada en geles de Tricina SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie e identificada con un anticuerpo policlonal de conejo antiCHH-A. La proteína producida, en un mayor volumen, fue precipitada del medio de cultivo con sulfato de amonio al 50%, dializada y fraccionada por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase de reversa (RP-HPLC) y corroborada mediante el anticuerpo antiCHH-A. La rCHH-AN purificada fue cuantificada por la técnica colorimétrica del ácido bicinconínico (BCA), obteniéndose un rendimiento final de 12.19 mg/l. La hormona fue utilizada para evaluar su efecto en osmorregulación mediante ensayos in vivo con camarones individuales subadultos de L. vannamei mantenidos a 26‰ inyectados en intermuda con 2 µg de rCHH-AN o PBS 1X (control) y posteriormente expuestos a condiciones iso-osmótico (26‰) o hipo-osmótico (10‰). Se tomaron muestras de hemolinfa a los 0.5, 1, 2 y 24 horas postinyección. La presión osmótica fue medida con un osmómetro de vapor, y las proteínas totales y los iones Na+, Cl- y K+ mediante kits comerciales colorimétricos. Los resultados mostraron un equilibrio osmótico en los camarones inyectados y expuestos a la salinidad de 26‰ y una respuesta hiper-osmótica en camarones inyectados y expuestos a una salinidad de 10‰. La hormona rCHH-AN reestableció de manera significativa la capacidad osmorreguladora en la hemolinfa al cabo de 2 h posteriores a la exposición a condiciones de salinidad baja, a diferencia del tratamiento con PBS, sugiriendo la participación de CHH-A en los procesos de osmoregulación en condiciones hipo-osmóticas. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de iones (Na+, Cl- y K+) entre los organismos inyectados con rCHH-AN y los de PBS al ser expuestos tanto a 26‰ como a 10‰. |
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