Expresión de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante (rCHH-A) de Litopenaeus vannamei y su efecto en la modulación de los niveles de glucosa
La respuesta fisiológica de los crustáceos está regulada en gran medida por un conjunto neurohormonas de origen peptídico. La hormona hiperglucémica de crustáceos (CHH), el miembro más abundante de la familia peptídica CHH/MIH/GIH/MOIH, es producida en el pedúnculo ocular. De las tres isoformas de...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2014 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/635 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/635 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/Autor/Hormona hiperglucémica info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Sumario: | La respuesta fisiológica de los crustáceos está regulada en gran medida por un conjunto neurohormonas de origen peptídico. La hormona hiperglucémica de crustáceos (CHH), el miembro más abundante de la familia peptídica CHH/MIH/GIH/MOIH, es producida en el pedúnculo ocular. De las tres isoformas de CHH que se han clonado de Litopenaeus vannamei, CHH-A resulta de gran interés ya que tiene el extremo C-terminal amidado, lo que pudiera ser importante para su actividad hiperglucémica. Este trabajo pretende llevar a cabo la clonación, expresión y purificación de la neurohormona CHH-A, utilizando los sistemas de expresión: E. coli BL21 DE3 y Pichia pastoris SMD1168H, con la finalidad de comparar los niveles de expresión de CHH-A entre los sistemas y evaluar su efecto en la regulación de los niveles de glucosa en L. vannamei. Para la clonación y mejor expresión de CHH-A, la secuencia del gen chhA fue optimizada con codones preferenciales para E. coli (plásmido CHHA-pUC57), amplificada por PCR y digerida con las mismas enzimas de restricción que el plásmido pET44a(+). Los productos fueron ligados y transformados a células de E. coli TOP10 y la construcción fue analizada por PCR y secuenciación. Asimismo, se montaron las condiciones para optimizar la expresión de CHH-A con un C-terminal adicional (c-myc, His-tag) en P. pastoris bajo el control de promotor inducible por metanol. Se probaron diferentes tiempos (24, 48 y 72 h) y concentraciones de metanol (1, 2 y 4%), encontrándose una mayor expresión con 2% de metanol a las 24 h de cultivo en medio complejo de nutrientes. rCHH-AHis fue purificada por cromatografía de afinidad, analizada por geles de Tricina-SDS-PAGE y su identidad corroborada utilizando anticuerpos contra el epítope c-myc. La hormona fue expresada, purificada y cuantificada a partir de un mayor volumen (100 ml), obteniéndose un rendimiento de 1.89 mg/L. Para determinar el efecto de rCHH-AHis en los niveles de glucosa de la hemolinfa del camarón, se inyectó la neurohormona a organismos juveniles a los cuales se les ablacionó un pedúnculo ocular, así como PBS y extracto de glándulas de dos pedúnculos oculares. Una hora post-inyección se tomó muestra de hemolinfa y la concentración de glucosa fue analizada. Los resultados mostraron que rCHH-AHis tuvo efecto en la modulación de los niveles de glucosa |
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