Expresión y purificación de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante nativa (rCHH-AN) y su participación en osmorregulación en Litopenaeus vannamei

La Hormona Hiperglucémica de Crustáceos (CHH) es la hormona más abundante producida en el órgano X-Glándula del seno, el principal centro neuroendócrino en crustáceos. La expresión de proteínas recombinantes en organismos como Pichia pastoris ha permitido obtener grandes cantidades de hormonas impli...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Verónica Yesenia Balderas González
Tipo de recurso: tesis de maestría
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2014
País:México
Institución:Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada
Repositorio:Repositorio Institucional CICESE
Idioma:español
OAI Identifier:oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/636
Acceso en línea:http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/636
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Expression and purification of recombinant native Crustacean hyperglycemic hormone (rCHH-AN) and its share in osmoregulation in Litopeneaus vannamei
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description La Hormona Hiperglucémica de Crustáceos (CHH) es la hormona más abundante producida en el órgano X-Glándula del seno, el principal centro neuroendócrino en crustáceos. La expresión de proteínas recombinantes en organismos como Pichia pastoris ha permitido obtener grandes cantidades de hormonas implicadas en los procesos endocrinos y fisiológicos. En el presente trabajo, se evaluó la expresión de la neurohormona CHH-A recombinante nativa (rCHH-AN) de Litopenaeus vannamei a partir de dos cepas metilotróficas  de P. pastoris, que contienen insertado en su genoma la secuencia que codifica para el péptido maduro de CHH-A (SMD1168H-CHHAN y X-33CHHAN). Dos medios de cultivo (complejo y mínimo) fueron evaluados por 4 días, inducidos con diferentes concentraciones de metanol (0, 1, 2 y 4%). La mejor condición de expresión se obtuvo con la cepa X-33-CHHAN, con el medio de cultivo complejo inducido con 2% de metanol por 24 horas. La hormona producida fue analizada en geles de Tricina SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie e identificada con un anticuerpo policlonal de conejo antiCHH-A. La proteína producida, en un mayor volumen, fue precipitada del medio de cultivo con sulfato de amonio al 50%, dializada y fraccionada por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase de reversa (RP-HPLC) y corroborada mediante el anticuerpo antiCHH-A. La rCHH-AN purificada fue cuantificada por la técnica colorimétrica del ácido bicinconínico (BCA), obteniéndose un rendimiento final de 12.19 mg/l. La hormona fue utilizada para evaluar su efecto en osmorregulación mediante ensayos in vivo con camarones individuales subadultos de L. vannamei mantenidos a 26‰  inyectados en intermuda con 2 µg de rCHH-AN  o  PBS 1X (control) y posteriormente expuestos a condiciones iso-osmótico (26‰) o hipo-osmótico (10‰). Se tomaron muestras de hemolinfa a los 0.5, 1, 2 y 24 horas postinyección. La presión osmótica fue medida con un osmómetro de vapor, y las proteínas totales y los iones Na+, Cl-  y K+ mediante kits comerciales colorimétricos. Los resultados mostraron un equilibrio osmótico en los camarones inyectados y expuestos a la salinidad de 26‰ y una respuesta hiper-osmótica en camarones  inyectados  y expuestos a una salinidad de 10‰. La hormona rCHH-AN reestableció de manera significativa la capacidad osmorreguladora en la hemolinfa al cabo de 2 h posteriores a la exposición a condiciones de salinidad baja, a diferencia del tratamiento con PBS, sugiriendo la participación de CHH-A en los procesos de osmoregulación en condiciones hipo-osmóticas. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de iones (Na+, Cl- y K+) entre los organismos inyectados con rCHH-AN y los de PBS al ser expuestos tanto a 26‰ como a 10‰.
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En el presente trabajo, se evaluó la expresión de la neurohormona CHH-A recombinante nativa (rCHH-AN) de Litopenaeus vannamei a partir de dos cepas metilotróficas  de P. pastoris, que contienen insertado en su genoma la secuencia que codifica para el péptido maduro de CHH-A (SMD1168H-CHHAN y X-33CHHAN). Dos medios de cultivo (complejo y mínimo) fueron evaluados por 4 días, inducidos con diferentes concentraciones de metanol (0, 1, 2 y 4%). La mejor condición de expresión se obtuvo con la cepa X-33-CHHAN, con el medio de cultivo complejo inducido con 2% de metanol por 24 horas. La hormona producida fue analizada en geles de Tricina SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie e identificada con un anticuerpo policlonal de conejo antiCHH-A. La proteína producida, en un mayor volumen, fue precipitada del medio de cultivo con sulfato de amonio al 50%, dializada y fraccionada por cromatografía líquida de alto rendimiento en fase de reversa (RP-HPLC) y corroborada mediante el anticuerpo antiCHH-A. La rCHH-AN purificada fue cuantificada por la técnica colorimétrica del ácido bicinconínico (BCA), obteniéndose un rendimiento final de 12.19 mg/l. La hormona fue utilizada para evaluar su efecto en osmorregulación mediante ensayos in vivo con camarones individuales subadultos de L. vannamei mantenidos a 26‰  inyectados en intermuda con 2 µg de rCHH-AN  o  PBS 1X (control) y posteriormente expuestos a condiciones iso-osmótico (26‰) o hipo-osmótico (10‰). Se tomaron muestras de hemolinfa a los 0.5, 1, 2 y 24 horas postinyección. La presión osmótica fue medida con un osmómetro de vapor, y las proteínas totales y los iones Na+, Cl-  y K+ mediante kits comerciales colorimétricos. Los resultados mostraron un equilibrio osmótico en los camarones inyectados y expuestos a la salinidad de 26‰ y una respuesta hiper-osmótica en camarones  inyectados  y expuestos a una salinidad de 10‰. La hormona rCHH-AN reestableció de manera significativa la capacidad osmorreguladora en la hemolinfa al cabo de 2 h posteriores a la exposición a condiciones de salinidad baja, a diferencia del tratamiento con PBS, sugiriendo la participación de CHH-A en los procesos de osmoregulación en condiciones hipo-osmóticas. No se encontraron diferencias significativas en la concentración de iones (Na+, Cl- y K+) entre los organismos inyectados con rCHH-AN y los de PBS al ser expuestos tanto a 26‰ como a 10‰.The Crustacean Hyperglucemic Hormone (CHH) is the most abundant peptide produced in the X-Organ-sinus gland, the principal crustacean neurosecretory complex. The recombinant protein expression in organisms such as Pichia pastoris has yielded large amounts of hormones involved in endocrine and physiological processes. In this work, the expression of the native recombinant neurohormone CHH-A (rCHH-AN) from Litopenaeus vannamei was evaluated from two methylotrophic P. pastoris strains containing inserted in the genome the sequence encoding the mature CHH-A peptide (SMD1168H-CHHAN y X-33-CHHAN).  Two culture media (complex and minimum) were tested for 4 days, induced with different concentrations of methanol (0, 1, 2 and 4%). The best condition of expression was obtained with the strain X-33-CHHAN, using the complex growth medium induced with 2% methanol for 24 hours. The hormone produced was analyzed on Tricine SDS-PAGE gels stained with Coomassie blue and identified with a polyclonal rabbit antibody antiCHH-A. The protein produced, in a larger volume, was precipitated from the culture medium with ammonium sulfate at 50%, dialyzed and fractionated by high performance liquid chromatography on reverse phase (RP-HPLC) and verified by antiCHH-A antibody. The purified rCHH-AN was quantified by the bicinchoninic acid colorimetric assay (BCA) to give a final yield of 12.19 mg /l. The hormone was used to evaluate its effect on osmoregulation by in vivo assays with single subadult L. vannamei shrimps maintained at 26‰ individually injected at inter-moult with 2 µg of rCHH-AN or 1X PBS (control) and subsequently exposed to a iso-osmotic (26‰) or hypo-osmotic (10‰) conditions. Haemolymph samples were drawn at 0.5, 1, 2 and 24 hours post injection. The osmotic pressure of haemolymph was measured in a vapor pressure osmometer, and total proteins and Na+, Cl- and K+ ions were determined by colorimetric commercial kits. The results showed osmotic equilibrium of shrimps injected and exposed to 26‰ salinity, and a hyperosmotic response of shrimps injected and exposed to 10‰ salinity. rCHH-AN injection was able to significantly restore the osmoregulatory capacity of the shrimps after 2 h of exposure to low salinity conditions, unlike the PBS treatment, suggesting the involvement of CHH-A in the control of osmoregulation in hypo-osmotic conditions. No significant differences were found in ion concentrations (Na+, Cl- and K+) between organisms injected with rCHH-AN and PBS after exposure to 26‰ or 10‰.CICESEElizabeth Ponce Rivas2014info:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/636reponame:Repositorio Institucional CICESEinstname:Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenadainstacron:CICESEspacitation:Balderas González, V.Y.2014.Expresión y purificación de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante nativa (rCHH-AN) y su participación en osmorregulación en Litopenaeus vannamei.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/6362024-08-28T03:49:44Z
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