Producción de la hormona recombinante hiperglucémica de crustáceos (CHH) e inhibidora de la muda (MIH) del camarón blanco Litopenaeus vannamei

El complejo OX-GS es considerado el principal órgano endócrino en crustáceos ya que sintetiza una serie de hormonas que intervienen en númerosos e importantes procesos fisiológicos. Entre las hormonas sintetizadas por este complejo, destaca la familia CHH/MIH/GIH la cual está relacionada con el desa...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Edna Sánchez Castrejón
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2008
País:México
Institución:Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada
Repositorio:Repositorio Institucional CICESE
Idioma:español
OAI Identifier:oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/1147
Acceso en línea:http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1147
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:info:eu-repo/classification/Autor/Litopenaeus vannamei,Proteínas recombinantes,Ciencias del mar
info:eu-repo/classification/cti/2
info:eu-repo/classification/cti/24
info:eu-repo/classification/cti/2414
Descripción
Sumario:El complejo OX-GS es considerado el principal órgano endócrino en crustáceos ya que sintetiza una serie de hormonas que intervienen en númerosos e importantes procesos fisiológicos. Entre las hormonas sintetizadas por este complejo, destaca la familia CHH/MIH/GIH la cual está relacionada con el desarrollo, crecimiento y reproducción del camarón. A pesar de la importancia de estas hormonas sus mecanismos de acción endócrina son poco conocidos, ya que estos estudios requieren de cantidades suficientes de hormonas las cuales son difíciles de obtener directamente de los animales. Es por ello que la tecnología del ADN recombinante representa una alternativa para la producción de estas hormonas las cuales puedan ser utilizadas en diferentes estudios fisiológicos así como de estructura-función. En este trabajo se presenta la clonación y expresión de los genes chh y mih de Litopenaeus vannamei para la producción de la hormona recombinante hiperglucémica de crustáceos (CHH) e inhibidora de la muda (MIH) a partir de un vector de expresión para Pichia pastoris el cual es inducible por metanol (pPICZαA) y presenta una señal de secreción (α- factor). Con el propósito de obtener proteínas recombinantes lo más parecidas a sus formas nativas, los genes fueron clonados con sus respectivos condones de término lo que interrumpió la traducción de las secuencias presentes en el vector de expresión que permiten el reconocimiento y purificación de las proteínas producidas. Una vez que se comprobó la correcta inserción de los genes en las clonas transformadas de P. pastoris (X- 33) por secuenciación, se procedió con el ensayo de inducción donde se determinaron las condiciones óptimas para la producción de las respectivas proteínas. El análisis de secuenciación del N-terminal de MIHn purificada por exclusión molecular y RP-HPLC evidenció la presencia de aminoácidos extras debido a un procesamiento incorrecto de las repeticiones Glu-Ala por la proteasa Kex2. Dado lo anterior se procedió con una nueva construcción en la que se incluyó un sitio de reconocimiento para la proteasa Enteroquinasa y la eliminación de las secuencias correspondientes a las repeticiones Glu-Ala. Como en el caso anterior, se verificó la correcta inserción de los genes y las condiciones óptimas para la producción de las proteínas en P. pastoris (KM71). El análisis de Western blot comprobó la síntesis de la hormona recombinante MIHHis. El rendimiento obtenido para esta proteína recombinante fue de 8.7 mg·l<sup>-1</sup>, el cual es superior al de otras hormonas recombinantes de camarón producidas en Pichia. El análisis de secuenciación de MIHHis indicó que la eliminación de las repeticiones Glu-Ala no afectó el procesamiento de la señal α-factor. Por otro lado, el sitio de reconocimiento para la enzima Enteroquinasa fue reconocido e hidrolizado exitosamente por la enzima. La actividad hiperglucémica de MIHHis fue corroborada mediante un ensayo in vivo, sin embargo no se descarta que también presente un efecto inhibitorio en la muda. Asimismo se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo contra un péptido sintético de MIH, obteniéndose un título alto de anticuerpos. Estos reconocieron a la hormona recombinante MIHHis por Western blot y mediante ensayos de ELISA se demostró que tienen un nivel de sensibilidad de 6.3 ng de proteína por lo que no fue posible utilizarlos para determinar los niveles de MIH a partir del extracto de glándula y hemolinfa por un ensayo de ELISA. Con lo que respecta a CHHHis esta no fue observada en los análisis en Western blot. Los ensayos de RT-PCR realizados evidenciaron la trascripción de chh, lo que se sugirió que el problema fue a nivel traduccional o postraduccional. Los anticuerpos anti-CHH obtenidos con un péptido sintético mostraron un alto título y los ensayos de Western blot mostraron dos bandas (15 y 30 kDa) en las muestras de extracto de glándulas que aunque no corresponden al tamaño esperado de CHH no se descarta la posibilidad de que sean multímeros de CHH ya que la proteína nativa es de 8-9 kDa. 

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