Análisis funcional y estructural de la proteína Clp de Xanthomonas campestris pv. campestris

"Clp (Crp-like protein) es el factor de transcripción global de la virulencia en la bacteria Gram negativa Xanthomonas campestris pv. campestris, fitopatógeno de una gran relevancia económica. A pesar de pertenecer a la superfamilia de factores de transcripción de CAP, Clp es único en su clase...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: EDGAR MARTINEZ GARCIA
Tipo de recurso: tesis de maestría
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2015
País:México
Institución:Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica
Repositorio:Repositorio Institucional del IPICYT
Idioma:español
OAI Identifier:oai:ipicyt.repositorioinstitucional.mx:1010/734
Acceso en línea:http://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1010/303
http://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1010/734
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:info:eu-repo/classification/Autor/Clp
info:eu-repo/classification/Autor/CAP
info:eu-repo/classification/Autor/Análisis estructural
info:eu-repo/classification/Autor/Complejo proteína-DNA
info:eu-repo/classification/Autor/Interacción proteína-DNA
info:eu-repo/classification/Autor/Factores de transcripción
info:eu-repo/classification/Autor/C-di-GMP
info:eu-repo/classification/cti/2
info:eu-repo/classification/cti/24
info:eu-repo/classification/cti/2415
Descripción
Sumario:"Clp (Crp-like protein) es el factor de transcripción global de la virulencia en la bacteria Gram negativa Xanthomonas campestris pv. campestris, fitopatógeno de una gran relevancia económica. A pesar de pertenecer a la superfamilia de factores de transcripción de CAP, Clp es único en su clase al no requerir de un modulador alostérico para ser capaz de unirse al DNA. De hecho, su ligando el cdi-GMP actúa como inhibidor al producir cambios alostéricos en la estructura terciaria de Clp. Estas características y la poca homología a nivel de secuencia y estructura con otros efectores de c-di-GMP hacen de Clp un factor de transcripción único. Nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional del complejo Clp-DNA. Como parte de nuestro diseño experimental, expresamos Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli utilizando el vector pET28pps La inducción se realizó con 0.2 mM de IPTG a 37 ºC por 8 horas tras un choque frío de 2 horas a 4 ºC. La purificación por cromatografía de afinidad a níquel en un amortiguador optimizado con 250 mM de NaCl, 100 mM de LiCl y 20 mM de Tris a pH 8.0 presentó un rendimiento de purificación de 3mg/L. Por análisis de Thermofluor se observó que el NaCl y el LiCl aumentaron la estabilidad térmica de Clp. El ensayo de movilidad por cromatografía de exclusión molecular mostró que el tiempo de retención disminuye para el complejo Clp-DNA (12.18 min = 242391 Da) con respecto al DNA por sí solo (19.10 min = 11329 Da). Las primeras pruebas de cristalización del complejo Clp-DNA mostraron una proporción de 23.2% de precipitados. De forma paralela se logró la subclonación de CAP en el vector pET28pps, la expresión y purificación arrojó un rendimiento de 24 mg/L. Esto servirá para un análisis comparativo de la interacción con el DNA de Clp y CAP por microscopía de fuerza atómica."

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