Generación y caracterización de tres bibliotecas sintéticas de anticuerpos basadas en tres marcos de anticuerpos vNAR
Los fragmentos de anticuerpos de dominio sencillo vNAR, derivados de tiburones, presentan características especiales en comparación con las moléculas convencionales de anticuerpos, como tamaño pequeño (12-15 kDa), estabilidad térmica y química y buena penetración tisular, entre otras. Estas carácter...
| Autor: | |
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| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | México |
| Recursos: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/3571 |
| Acesso em linha: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3571 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | info:eu-repo/classification/Autor/Anticuerpos, vNAR, anticuerpos de dominio sencillo, bibliotecas sintéticas, VEGF, angiogénesis info:eu-repo/classification/Autor/Antibodies, vNAR, single domain antibodies, synthetic libraries, VEGF, angiogenesis info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2499 info:eu-repo/classification/cti/249999 |
| Resumo: | Los fragmentos de anticuerpos de dominio sencillo vNAR, derivados de tiburones, presentan características especiales en comparación con las moléculas convencionales de anticuerpos, como tamaño pequeño (12-15 kDa), estabilidad térmica y química y buena penetración tisular, entre otras. Estas carácterísticas los vuelven una buena fuente alternativa de agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por lo tanto, es esencial mejorar las técnicas utilizadas para el desarrollo y la selección de fragmentos vNAR que reconozcan y neutralicen a distintos antígenos. El desarrollo de bibliotecas sintéticas de fragmentos de anticuerpos, ofrece una opción rápida para la generación de anticuerpos con las características deseadas. En este trabajo se construyeron tres bibliotecas sintéticas de vNAR, nombradas VS0, VS1 y VS2, utilizando marcos de anticuerpos vNAR sin cisteínas, con una cisteína y con dos residuos de cisteínas dentro de su CDR3, respectivamente, con el objetivo de determinar si la presencia o ausencia de cisteínas en la CDR3 favorece el aislamiento de clonas vNAR de una biblioteca sintética. Las bibliotecas VS0, VS1 y VS2 presentaron tamaños de 1.2x109, 4.0x109 y 3.4x1011 transformantes en total, respectivamente. Las bibliotecas se validaron realizando una selección contra seis proteínas de mamíferos (AQP1, VEGF, FGF-2, LIF, GYPA y CEA) y eritrocitos de gallina. Se obtuvo al menos un anticuerpo contra cada uno de los antígenos, y se aisló una clona contra todos los antígenos a partir de la selección con la biblioteca sin cisteína en su CDR3. Se evaluó la funcionalidad de los anticuerpos seleccionados contra VEGF y CEA. Dos anticuerpos aislados contra VEGF (VS1-20 y VS0-4) fueron capaces de inhibir la angiogénesis in vitro en un modelo tridimensional de células endoteliales. En conclusión, nuestros resultados sugieren que durante la construcción de bibliotecas sintéticas el uso de marcos vNAR sin cisteínas en el CDR3 podría incrementar el aislamiento de anticuerpos funcionales de las bibliotecas y que tener un gran número de transformantes no garantiza el éxito de la biblioteca, como se obsercó con VS2. Además, los resultados de los ensayos de angiogénesis in vitro y análisis in silico con los anticuerpos anti-VEGF sugieren que los anticuerpos aislados de bibliotecas sintéticas pueden rivalizar a los anticuerpos aislados de bibliotecas inmunes naturales e incluso a los anticuerpos cuya afinidad ha sido mejorada a través de modelado in silico. |
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