Diagnóstico molecular de Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG mediante amplificación por círculo rodante con sondas padlock

"CONTEXTO. El diagnóstico de la tuberculosis (TB) zoonótica requiere métodos rápidos, confiables y accesibles que distingan Mycobacterium bovis en la población humana de alto riesgo, pues los métodos microbiológicos tradicionales para diferenciar las especies del Complejo Mycobacterium tubercul...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: ALAN YTZEEN MARTINEZ CASTELLANOS
Tipo de recurso: tesis de maestría
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2014
País:México
Institución:Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica
Repositorio:Repositorio Institucional del IPICYT
OAI Identifier:oai:ipicyt.repositorioinstitucional.mx:1010/1533
Acceso en línea:http://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1010/1533
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:info:eu-repo/classification/Autor/Mycobacterium bovis
info:eu-repo/classification/Autor/Regiones de diferenciación
info:eu-repo/classification/Autor/Amplificación por círculo rodante
info:eu-repo/classification/Autor/Sondas padlock
info:eu-repo/classification/cti/2
info:eu-repo/classification/cti/24
info:eu-repo/classification/cti/2415
Descripción
Sumario:"CONTEXTO. El diagnóstico de la tuberculosis (TB) zoonótica requiere métodos rápidos, confiables y accesibles que distingan Mycobacterium bovis en la población humana de alto riesgo, pues los métodos microbiológicos tradicionales para diferenciar las especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) son laboriosos y toman varias semanas. Los métodos moleculares para identificar M. bovis se basan en la persistencia de diversas regiones de diferenciación (RD) en los genomas del CMTB. La amplificación por círculo rodante (RCA) basada en sondas padlock circularizables dirigidas a secuencias específicas es un método de amplificación de ácidos nucleicos de nueva generación. El objetivo de este estudio fue desarrollar sondas padlock que distingan segmentos específicos de las regiones de diferenciación RD1, RD4 y RD9 de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG. MÉTODOS. Utilizamos las secuencias del flanco izquierdo y el inicio del extremo 5’ de las regiones RD1, RD4 y RD9 de M. tuberculosis y elementos espaciadores de diferente longitud para construir tres sondas padlock denominadas SP5’RD1, SP5’RD4 y SP5’RD9.Las sondas armadas fueron validadas in silico para descartar la generación de productos de amplificación inespecíficos y la formación de asas de cadena doble en los brazos de captura y extensión que pudiesen interferir con su ligación e hibridación a las secuencias blanco. Posteriormente, ensayamos primero la RCA en mezclas que contenían la sonda SP5’RD4 y una construcción de DNA circular con el insertodeRD4+o el amplicón lineal RD4+. Después determinamos el número mínimo de copias de la secuencia blanco detectables y la cinética de la RCA. RESULTADOS. Los ensayos con SP5’RD4 y el vector de DNA circular con el inserto RD4+ generaron monómeros con la longitud unitaria del vector plasmídico, en tanto que con el amplicón lineal generaron los monómeros esperados; en ensayos ulteriores con todas las sondas SP5’ no empleamos blancos de DNA circular sino lineales (i.e., amplicones o DNA genómico del CMTB). Los ensayos con DNA de las cepas de referencia M. tuberculosis H37Rv y M. bovis AN5 generaron los monómeros esperados para las tres sondas y pudieron detectar desde tres copias de genomas del CMTB en 5 h (90 min para la ligación, 120 min para la RCA, 90 min para la restricción y 120 min para el análisis electroforético)."

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