Nanobiorreactores con actividad enzimática como terapia para la galactosemia clásica.
La galactosemia clásica es una enfermedad hereditaria que resulta en la deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), cuando la actividad de GALT es deficiente en el organismo se acumulan compuestos tóxicos como el galactitol o galactonato que comprometen seriamente la salud...
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/2828 |
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Nanobiorreactores con actividad enzimática como terapia para la galactosemia clásica. Nanobioreactors with catalitic activity for classic galactosemia therapy. |
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La galactosemia clásica es una enfermedad hereditaria que resulta en la deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), cuando la actividad de GALT es deficiente en el organismo se acumulan compuestos tóxicos como el galactitol o galactonato que comprometen seriamente la salud de los pacientes. El objetivo de este proyecto fue sintetizar nanopartículas con actividad catalítica GALT para aplicaciones en la terapia de la galactosemia clásica. Para alcanzar el objetivo, realizamos la síntesis de bionanorreactores (GALT-BMV) con actividad enzimática GALT mediante la encapsidación de la enzima GALT dentro de cápsides del virus BMV por el método de autoensamble. Nosotros adquirimos la enzima comercial GALT y por otra parte produjimos y purificamos virus nativo BMV a partir de plantas previamente infectadas, del virus obtenido se aisló y purifico la proteína de capside CP-BMV necesaria para el ensamble. Se probaron tres relaciones en masa de la proteína CP con respecto a la enzima GALT para la reacción ensamble y a partir de un ensayo de movilidad electroforética determinamos cuál de estas relaciones es la más efectiva para la síntesis de nanopartículas GALT-BMV. En función de la relación optima encontrada realizamos un ensayo de síntesis a mayor escala para producir muestra suficiente para los ensayos de caracterización. La actividad enzimática GALT fue caracterizada y cuantificada por la aparición de producto (UDP-galactosa) de la reacción con ayuda de un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Se cuantifico la actividad catalítica tanto de la enzima GALT-libre, así como de la enzima confinada dentro de las cápsides virales GALT-BMV. Con la información de los cromatogramas obtenidos por el HLPC, se realizó una regresión de Michaelis-Menten, respectivamente. Bajo este análisis, encontramos que el sustrato es más afín a la enzima cuando está en forma libre (K_M=0.91) que cuando esta confinada GALT-BMV (K_M=1.64). Nosotros encontramos que la enzima encapsidada tiene un rendimiento del 16% de la actividad catalítica, K_cat de 282.6 min-1, en comparación con la enzima GALT-libre K_cat de 1,709.9 min-1. Con las micrografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión encontramos que los bionnaoreactores sintetizados poseen una geometría cuasi-esférica y de tamaño de 28±8.2nm y por lo tanto numero triangulación T=3. Finalmente, concluimos que sintetizamos nanopartículas GALT-BMV con actividad enzimática GALT y ... |
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citation:Gama López, P.A. 2019. Nanobiorreactores con actividad enzimática como terapia para la galactosemia clásica. Tesis de Maestría en Ciencias.Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 53 pp. |
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El objetivo de este proyecto fue sintetizar nanopartículas con actividad catalítica GALT para aplicaciones en la terapia de la galactosemia clásica. Para alcanzar el objetivo, realizamos la síntesis de bionanorreactores (GALT-BMV) con actividad enzimática GALT mediante la encapsidación de la enzima GALT dentro de cápsides del virus BMV por el método de autoensamble. Nosotros adquirimos la enzima comercial GALT y por otra parte produjimos y purificamos virus nativo BMV a partir de plantas previamente infectadas, del virus obtenido se aisló y purifico la proteína de capside CP-BMV necesaria para el ensamble. Se probaron tres relaciones en masa de la proteína CP con respecto a la enzima GALT para la reacción ensamble y a partir de un ensayo de movilidad electroforética determinamos cuál de estas relaciones es la más efectiva para la síntesis de nanopartículas GALT-BMV. En función de la relación optima encontrada realizamos un ensayo de síntesis a mayor escala para producir muestra suficiente para los ensayos de caracterización. La actividad enzimática GALT fue caracterizada y cuantificada por la aparición de producto (UDP-galactosa) de la reacción con ayuda de un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Se cuantifico la actividad catalítica tanto de la enzima GALT-libre, así como de la enzima confinada dentro de las cápsides virales GALT-BMV. Con la información de los cromatogramas obtenidos por el HLPC, se realizó una regresión de Michaelis-Menten, respectivamente. Bajo este análisis, encontramos que el sustrato es más afín a la enzima cuando está en forma libre (K_M=0.91) que cuando esta confinada GALT-BMV (K_M=1.64). Nosotros encontramos que la enzima encapsidada tiene un rendimiento del 16% de la actividad catalítica, K_cat de 282.6 min-1, en comparación con la enzima GALT-libre K_cat de 1,709.9 min-1. Con las micrografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión encontramos que los bionnaoreactores sintetizados poseen una geometría cuasi-esférica y de tamaño de 28±8.2nm y por lo tanto numero triangulación T=3. Finalmente, concluimos que sintetizamos nanopartículas GALT-BMV con actividad enzimática GALT y ...Classic galactosemia is a hereditary disease that implies a deficiency in galactose-1-phosphate uridyl transferase (GALT) enzyme. When GALT enzyme activity is not efficient in the organism, this implies an accumulation of toxic compounds such as galactitol or galactonate, which seriously risks patients’ health. The main objective of this project was to synthesize nanoparticles with GALT catalytic activity for applications in classic galactosemia therapy. To achieve it, the synthesis of bionanoreactors (GALT-BMW) with GALT enzymatic activity was performe thorough the encapsidation of the GALT enzyme inside the BMV virus capsids using molecular self-assembly. A commercial version of GALT human enzyme was acquired, and native BMW virus was purified through previously infected plants, obtaining the CP-BMW capsid protein needed for the assembly. Three in mass relationships between CP and GALT enzyme for the assembly reaction were tested and starting from an Electrophoretic Mobility Assay the effectivity of each relationship in the synthetization of GALT-BMW nanoparticles was proved in other to obtain the most effective one. From the optim relationship, a synthesis assay was made in a larger scale to produce enough sample for the catalytic and structural characterization assays. Enzymatic GALT activity was characterized and quantified by means of High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). There was a characterization of catalytic activity of GALT-free enzyme and the enzyme confined to the viral capsid GALT-BMW as well. Using the information provided by the HPLC chromatographs a Michaels-Menten regression was performe for both cases. We find that the substrate is more related to the enzyme in its free form (K_M=0.91) than when it’s confined GALT-BMV (K_M=1.64). The encapsidated enzyme has a 16% performance from catalytic activity, K_cat of 282.6 min-1 in comparison to the GALT-free enzyme, which shows a K_cat of 1,709.9 min-1. Micrography obtained by Transmission Electron Microscopy show that the symmetry of the synthetized bionanoreactors is semi-spherical, with a 28±8.2nm size and a triangulation number of T=3. It is concluded that GALT-BMW nanoparticles with enzymatic GALT activity were synthetized and they have a high potential for their use in classical galactosemia treatment.CICESERafael Vázquez Duhalt2019info:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2828reponame:Repositorio Institucional CICESEinstname:Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenadainstacron:CICESEspacitation:Gama López, P.A. 2019. Nanobiorreactores con actividad enzimática como terapia para la galactosemia clásica. Tesis de Maestría en Ciencias.Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 53 pp.info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/28282024-08-28T03:50:04Z |
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