Nanobiorreactores con actividad enzimática como terapia para la galactosemia clásica.
La galactosemia clásica es una enfermedad hereditaria que resulta en la deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), cuando la actividad de GALT es deficiente en el organismo se acumulan compuestos tóxicos como el galactitol o galactonato que comprometen seriamente la salud...
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/2828 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2828 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/Autor/Galactosemia clásica, Galactosa-1-fosfato uridiltranferasa (GALT), bionanorreactores, cápsides virales, BMV info:eu-repo/classification/autor/Classic galactosemia, galactose-1-phosphate uridyl transferase (GALT), bionanoreactors, virus capsids, BMV info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2403 info:eu-repo/classification/cti/230205 |
| Sumario: | La galactosemia clásica es una enfermedad hereditaria que resulta en la deficiencia de la enzima galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT), cuando la actividad de GALT es deficiente en el organismo se acumulan compuestos tóxicos como el galactitol o galactonato que comprometen seriamente la salud de los pacientes. El objetivo de este proyecto fue sintetizar nanopartículas con actividad catalítica GALT para aplicaciones en la terapia de la galactosemia clásica. Para alcanzar el objetivo, realizamos la síntesis de bionanorreactores (GALT-BMV) con actividad enzimática GALT mediante la encapsidación de la enzima GALT dentro de cápsides del virus BMV por el método de autoensamble. Nosotros adquirimos la enzima comercial GALT y por otra parte produjimos y purificamos virus nativo BMV a partir de plantas previamente infectadas, del virus obtenido se aisló y purifico la proteína de capside CP-BMV necesaria para el ensamble. Se probaron tres relaciones en masa de la proteína CP con respecto a la enzima GALT para la reacción ensamble y a partir de un ensayo de movilidad electroforética determinamos cuál de estas relaciones es la más efectiva para la síntesis de nanopartículas GALT-BMV. En función de la relación optima encontrada realizamos un ensayo de síntesis a mayor escala para producir muestra suficiente para los ensayos de caracterización. La actividad enzimática GALT fue caracterizada y cuantificada por la aparición de producto (UDP-galactosa) de la reacción con ayuda de un equipo de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Se cuantifico la actividad catalítica tanto de la enzima GALT-libre, así como de la enzima confinada dentro de las cápsides virales GALT-BMV. Con la información de los cromatogramas obtenidos por el HLPC, se realizó una regresión de Michaelis-Menten, respectivamente. Bajo este análisis, encontramos que el sustrato es más afín a la enzima cuando está en forma libre (K_M=0.91) que cuando esta confinada GALT-BMV (K_M=1.64). Nosotros encontramos que la enzima encapsidada tiene un rendimiento del 16% de la actividad catalítica, K_cat de 282.6 min-1, en comparación con la enzima GALT-libre K_cat de 1,709.9 min-1. Con las micrografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión encontramos que los bionnaoreactores sintetizados poseen una geometría cuasi-esférica y de tamaño de 28±8.2nm y por lo tanto numero triangulación T=3. Finalmente, concluimos que sintetizamos nanopartículas GALT-BMV con actividad enzimática GALT y ... |
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