Vitrificación de ovocitos bovinos mediante la técnica Open Pulled Straw

Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la criopreservación de los ovocitos obtenidos de terneras prepúberes o de vacas adultas en la organización de los cromosomas, la morfología de los microtúbulos y la estructura del citoesqueleto, y el posterior desarrollo embrionario, para esto se...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Albarracín Monje, José Luis
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2005
País:España
Institución:Universitat Autònoma de Barcelona
Repositorio:Dipòsit Digital de Documents de la UAB
Idioma:español
OAI Identifier:oai:ddd.uab.cat:36503
Acceso en línea:https://ddd.uab.cat/record/36503
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Oòcits
Vaques
Descripción
Sumario:Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la criopreservación de los ovocitos obtenidos de terneras prepúberes o de vacas adultas en la organización de los cromosomas, la morfología de los microtúbulos y la estructura del citoesqueleto, y el posterior desarrollo embrionario, para esto se realizaron tres grupos experimentales. En el primer grupo experimental los ovocitos una vez madurados in vitro (IVM), fueron divididos en 3 grupos según si eran: 1) sin ningún tratamiento (control); 2) expuesto a los agentes crioprotectores (CPAs); o 3) criopreservados por el método del vitrification de la open pulled straw (OPS). Después de descongelar los ovocitos una muestra de estos eran fijadas en paraformaldehido para posteriormente realizar técnicas de inmunofluorescencia específicas y examinadas debajo de un microscopio confocal. Los ovocitos restantes fueron fecundados y el porcentaje de división celular y desarrollo embrionario fueron registradas a las 48 h y 7 días post inseminación, respectivamente. Después de la vitrification o de la exposición a los CPAs, un porcentaje significativamente elevado de ovocitos mostraron cambios en la morfología del huso comparado al grupo control. La estructura de la placa metafásica de ovocitos de vaca madurados in vitro fue significativamente más resistente al proceso del vitrificación por OPS. La vitrificación de ovocitos procedentes de terneras o vacas adultas mostraron un aumento significativo en el porcentaje de ovocitos que presentaban banda de actina discontinua o ausencia de ésta comparado con los controles no tratados. Los ovocitos expuesto solamente a los CPAs mostraron un aspecto similar a los controles. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en los ovocitos tanto de vaca como de ternera, independientemente del tratamiento. La división embrionaria y el porcentaje de blastocistos fueron significativamente menores en aquellos ovocitos vitrificados comparado con los ovocitos control. Los ovocitos obtenido de vacas adultas fueron más sensibles a la exposición a los CPAs, mientras que el proceso de vitrificación parecía tener efectos más perjudiciales en los ovocitos de ternera. En el segundo experimento la Roscovitina fue utilizado para mantener ovocitos de ternera en la etapa de vesícula germinal durante un período de 24 h. Los complejos cúmulus-ovocito fueron aspirados de ovarios de ternera y cultivados durante 24 h en TCM199 que contenía diversas concentraciones de Roscovitina (0, 12.5, 25, 50 y 100 m). Después de este período de premaduración, un grupo de ovocitos fueron fijados para lacmoide o para inmunohistoquímica y el resto fueron cultivados durante 24 h más en las condiciones permisivas de maduración. Los ovocitos cultivados con Roscovitina, en todas las concentraciones probadas, fueron bloqueados en estadio de vesícula germinal. El efecto inhibitorio varió según la dosis, siendo las concentraciones más altas las más eficientes, produciendo el bloqueo en estadio de Vesícula Germinal en más del 60.0% de los ovocitos. Sin embargo, este efecto inhibitorio de la Roscovitina fue completamente reversible. El porcentaje de división y desarrollo embrionario de aquellos ovocitos premadurados con 50 m de Roscovitina no fueron significativamente diferentes comparado a los ovocitos control. La morfología de la placa metafásica fue la típica del estadio de metafase II en el 75.8% de los ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II después del tratamiento previo con 50 m de Roscovitina no difiriendo significativamente del grupo control. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en un 97.0% y 98.2% de ovocitos expuestos a 50 m Roscovitina comparada al control, respectivamente. Estos resultados demuestran la viabilidad de mantener los ovocitos de ternera en parada meiótica artificial sin comprometer su capacidad de desarrollo subsiguiente. En el último grupo experimental, el estudio fue diseñado para establecer los efectos del estadio de maduración nuclear de los ovocitos de ternera y de un tratamiento de premaduración con Roscovitina (ROS) sobre la resistencia a la criopreservación. Los ovocitos de ternera fueron vitrificados mediante OPS en estadio de vesícula germinal rota (GVBD) o en metafase II (MII). En otro experimento, los ovocitos en vesícula germinal rota fueron premadurados con 50 M de ROS antes de la vitrificación. Después de la descongelación, los ovocitos en estadio de GVBD y aquellos premadurados con ROS y vitrificados en VGBD fueron madurados durante 18 h adicionales, mientras que aquellos vitrificados en estadio de MII fueron madurados durante 2 h más. Porcentajes significativamente más bajos de división embrionaria fueron obtenidos para el aquellos ovocitos vitrificados en estadio de GVBD y MII (9.9% y 12.6%, respectivamente) comparados con los ovocitos del grupo control (73.9%). Porcentajes de división embrionaria significativamente inferiores fueron obtenidos en aquellos ovocitos que fueron vitrificados en estadio de VGBD previa premaduración con ROS comparados con los ovocitos control o comparados con los ovocitos del grupo ROS-CONTROL. Independientemente del estadio de maduración nuclear en el que fueron vitrificados, no se obtuvo desarrollo embrionario. Un porcentaje significativamente inferior de ovocitos presentaban una placa metafásica normal después de ser expuestos a los crioprotectores y vitrificados (independientemente del estadio de maduración) comparado con los controles. Estos resultados indican que el protocolo del vitrification tiene un efecto negativo en la organización de la placa metafásica de los ovocitos de ternera vitrificados tanto en estadio de MI como de VGBD, lo cual afecta el posterior desarrollo embrionario. El tratamiento del premaduración con el ROS no tiene ningún efecto beneficioso en el resultado del vitrification por el método de OPS.

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