Optimizing vitrification of in vitro matured bovine oocytes
La gran quantitat de beneficis que ofereix la crioconservació d'oòcits bovins ha incrementat dràsticament la demanda d'oòcits bovins. En aquest context, la crioconservació exitosa d'oòcits bovins madurats in vitro resulta de vital importància per garantir l'abastiment d'oòci...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2017 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:188059 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/188059 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Oòcits Vaques Reproducció assistida Expressió gènica |
| Sumario: | La gran quantitat de beneficis que ofereix la crioconservació d'oòcits bovins ha incrementat dràsticament la demanda d'oòcits bovins. En aquest context, la crioconservació exitosa d'oòcits bovins madurats in vitro resulta de vital importància per garantir l'abastiment d'oòcits bovins. No obstant això, encara no s'ha aconseguit un protocol de vitrificació d'oòcits bovins eficient i eficaç. L'objectiu d'aquesta tesis és, per tant, investigar la utilització d'elevades concentracions de NaCl o sucrosa abans de la vitrificació i escalfament, l'enriquiment de l'oolema amb colesterol abans de la vitrificació i l'addició d'un biopolímer sintetitzat per un bacteri de l' Antàrctica durant la vitrificació i escalfament, com a estratègies per millorar els protocols de vitrificació d'oòcits. S'ha descrit que l'exposició dels oòcits a concentracions elevades de clorur sòdic, sucrosa i trehalosa abans de la manipulació millora la criotolerància a la vitrificació i la capacitat de desenvolupament en l'espècie porcina. En el capítol IV d'aquesta tesis vam observar que el tractament amb solucions de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durant una hora abans de la vitrificació, no tenia efectes perjudicials per l'estat del fus meiòtic dels oòcits bovins madurats in vitro. Concretament, el pretractament amb sucrosa abans de la vitrificació no va ser capaç de millorar el desenvolupament embrionari com s'havia observat en altres espècies. L'enriquiment de la membrana amb colesterol podria incrementar la fluïdesa i la permeabilitat de la membrana i augmentar la criotolerància dels oòcits a la crioconservació. En el capítol V d'aquesta tesis vam utilitzar bodipy-colesterol per visualitzar el transport del colesterol per microscòpia confocal en oòcits bovins madurats in vitro. Aquest mètode ens va permetre determinar el temps d'incubació necessari per una incorporació òptima del colesterol a la membrana i evitar la no desitjada penetració al citoplasma, utilitzant diferents concentracions de metil-β-cyclodextrines carregades amb colesterol. Tot i que no es va aconseguir millorar la criotolerància en termes de supervivència i capacitat de desenvolupament, l'addició de colesterol alterava l'expressió de gens relacionats amb el metabolisme lipídic, (CYP51), apoptosis (BAX) i metilació del DNA (DNMT3A) en mòrules bovines, sobretot quan els oòcits eren vitrificats a estadi de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, un bacteri aïllat del sediment marí de l'Antàrtica, produeix un polisacàrid com a mecanisme de tolerància al refredament (M1 EPS). Aquest exopolisacàrid també confereix crioprotecció per altres cèl·lules bacterianes, suggerint que pot ser utilitzat com a agent per la crioconservació cel·lular. En el capítol VI es va afegir M1 EPS a les solucions de vitrificació i escalfament com a agent bloquejant de la formació de gel, per limitar el dany dels oòcits bovins madurats in vitro i incrementar posteriorment la capacitat de desenvolupament. Es van analitzar els efectes de la suplementació amb diferents concentracions de M1 EPS en l'organització dels fusos meiòtics, la capacitat de desenvolupament en termes de percentatges de blastocists i l'expressió gènica en blastocists de dia 8. La suplementació amb M1 EPS durant la vitrificació i escalfament dels oòcits de vedella prepúber madurats in vitro protegia el fus meiòtic contra la descondensació de cromosomes i microtúbuls causada per la vitrificació. Tot i que després del suplement amb M1 EPS no es va observar millora en els percentatges de blastocists, es van registrar diferents canvis en l'expressió d'alguns gens relacionats amb epigenètica (DNMT3A i KAT2A) i qualitat embrionària (BAX, BCL2) entre blastocists obtinguts a partir d'oòcits vitrificats amb diferents concentracions de M1 EPS. En resum, basant-nos en els resultats d'aquesta tesis, podem concloure que la criotolerància dels oòcits bovins madurats in vitro no només depèn del dany que pateixin en l'organització del fus meiòtic. Sinó que també en els canvis en l'expressió gènica que condicionen el posterior desenvolupament embrionari. |
|---|