Procarboxipeptidases humanes
L'estudi portat a terme en la tesi doctoral tracta sobre la relació estructura/funció de metalülocarboxipeptidases humanes, també anomenades carboxipeptidases (CPs). El treball realitzat s'ha dividit en dues parts diferenciades: una primera centrada en estudis funcionals i una segona part...
| Autores: | , |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2003 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | catalán |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:36943 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/36943 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Procarboxipeptidases Carboxipeptidases |
| Sumario: | L'estudi portat a terme en la tesi doctoral tracta sobre la relació estructura/funció de metalülocarboxipeptidases humanes, també anomenades carboxipeptidases (CPs). El treball realitzat s'ha dividit en dues parts diferenciades: una primera centrada en estudis funcionals i una segona part que conté estudis estructurals. Algunes CPs se sintetitzen en forma inactiva: les procarboxipeptidases (PCPs), les quals presenten segments d'activació d'una longitud de 91-96 residus, els quals han d'ésser separats del domini enzimàtic mitjançant un atac proteolític per part d'una proteasa activant. En la primera part d'aquest treball, l'optimització de sistemes d'expressió heteròloga i purificació per a la PCPA1 i PCPB humanes ha permès l'obtenció de quantitats suficients de proteïna per a realitzar un estudi detallat dels seus mecanismes d'activació. Així mateix, s'ha aplicat el mateix sistema d'expressió i purificació al mutant D255K de la PCPB humana. En contrast amb el que s'havia determinat per a la PCPA1 porcina, la PCPA1 humana presenta un mecanisme d'activació més semblant al de les formes B i A2: calen unes condicions d'activació suaus i se segueix una cinètica d'activació monotònica, en què el segment pro del proenzim no presenta activitat inhibidora sobre la carboxipeptidasa generada, essent el tall tríptic primari suficient per alliberar-lo de l'enzim. L'estudi comparatiu dels processos d'activació de la PCPB humana tipus salvatge i del seu mutant amb especificitat reversa D255K demostra la participació de la CPB en el processament del seu segment pro. D'altra banda, la generació d'una nova diana tríptica sobre Arg93A durant el procés d'activació del mutant pot indicar que la introducció de la mutació provoca una distorsió de les interaccions entre el segment pro i el domini enzimàtic. La segona part del treball es centra en estudis estructurals. D'una banda, s'ha resolt l'estructura de la PCPB humana, la qual és molt semblant a la d'altres PCPs prèviament estudiades i s'observa que la zona més variable és la regió de connexió entre el domini d'activació globular i el domini enzimàtic. Pel que fa a l'arquitectura del centre actiu, s'observen conformacions alternatives en certs residus del centre actiu. La resolució de l'estructura tridimensional de la PCPB humana, junt amb la d'altres estructures de PCPs prèviament obtingudes, ha permès l'obtenció d'un model acurat de la TAFI, un proenzim d'elevada rellevància biomèdica. L'estudi d'aquest model i l'anàlisi del seu perfil d'energia pseudopotencial permet l'elaboració d'una hipòtesi per explicar la inestabilitat conformacional intrínseca de la seva forma activa. D'altra banda, s'han modelat les estructures de tres nous membres de la família de les metalülocarboxipeptidases, els quals han estat identificats mitjançant cerques en la base de dades del genoma humà. D'acord amb la predicció de les seves especificitats els enzims s'han anomenat CPA5, CPA6 i CPO. La PCPA5 presenta major similülitud amb la PCPA1 i PCPA2 pancreàtiques. L'anàlisi de la butxaca d'especificitat indica que la l'enzim actiu mostra especificitat tipus A, amb una possible preferència per a residus C-terminals alifàtics petits. El model de la PCPA6 presenta una estructura més semblant a la PCPB, però l'especificitat predita per a l'enzim actiu és de tipus A. Les substitucions en la seva butxaca d'especificitat indiquen que la CPA6 podria presentar major eficiència en el processament de residus C-terminals hidrofòbics grans. Per a la CPO només s'ha modelat el domini enzimàtic, ja que els possibles exons codificants de la regió N-terminal no van poder ser identificats. La CPO presenta una estructura semblant a la de la CPB, però una sèrie de substitucions en la seva butxaca especificitat indiquen que presenta una nova especificitat no descrita fins ara per a residus C-terminals àcids. |
|---|