A Step forward in recombinant protein production regulated by the constitutive GAP promoter in Pichia pastoris through bioprocess engineering approaches
La producció de proteïnes recombinants, tant per aplicacions terapèutiques com industrials, dóna lloc a un mercat que anualment genera milers de milions de dòlars. Entre els organismes hostes destacats que solen ser emprats per a la seva producció, actualment el llevat Pichia pastoris és una de les...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2016 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:166113 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/166113 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Biotecnologia Proteïnes recombinants Pichia Pastoris Unions cel·lulars |
| Sumario: | La producció de proteïnes recombinants, tant per aplicacions terapèutiques com industrials, dóna lloc a un mercat que anualment genera milers de milions de dòlars. Entre els organismes hostes destacats que solen ser emprats per a la seva producció, actualment el llevat Pichia pastoris és una de les plataformes d'expressió més efectives i versàtils. Des d'un punt de vista operacional i industrial, i com a alternativa als àmpliament estesos processos basats la utilització de metanol, l'ús del promotor constitutiu GAP ofereix avantatges molt importants. Malgrat aquestes avantatges, però, el desenvolupament d'estratègies de cultiu que doni lloc a processos de producció eficients regulats pel promotor GAP està considerat, encara avui en dia, en un estadi molt primerenc. Al llarg del curs d'aquesta tesi, diversos paràmetres claus per a assolir millores en termes de rendiment i productivitat en els processos de producció de proteïnes recombinants amb l'esmentat sistema d'expressió van ser abordats a través de les eines de l'enginyeria de bioprocessos. El desenvolupament i implementació de noves estratègies de cultiu va ser dut a terme per a una soca de P. pastoris que expressa constitutivament el fragment d'unió a antigen (Fab) humà 2F5 com a proteïna model. No obstant, s'espera que les millores en els processos de producció assolits siguin també aplicables a l'expressió d'altres proteïnes recombinants d'interès. Inicialment, amb l'objectiu de valorar l'efecte causat per la capacitat de secreció limitada àmpliament estudiada en aquest hoste d'expressió, un protocol de disrupció cel·lular i d'extracció de proteïnes va ser desenvolupat i optimitzat. Aquests mètodes van permetre assolir un increment molt important en la precisió, i per tant en la veracitat, de la quantificació de producte retingut intracel·lularment. L'ús de glucosa i de glicerol com a fonts de carboni va ser comparat per les dues fases del cultiu en fed-batch. La selecció de diferents substrats per a cadascuna de les fases va donar lloc a efecte positius importants en el cultiu. Addicionalment, l'efecte de la taxa específica de creixement a la taxa de específica producció va ser estudiat mostrant una clara relació entre la formació de producte i el creixement de biomassa com a resultat d'un important efecte transcripcional de la taxa específica de creixement en el metabolisme central del carboni, i a la vegada, en l'expressió de la proteïna d'interès. Per contra, no va poder ser observat un efecte evident de la taxa específica de creixement a la capacitat de secreció del llevat. Per tant, es van dur a terme cultius en fed-batch a una taxa de creixement alta i constant assolint taxes de producció significativament més elevades respecte d'altres cultiu basats en altres estratègies d'alimentació de font de carboni. L'impacte de condicions ambientals d'estrès a la fisiologia cel·lular de l'hoste va ser caracteritzat i estudiat amb l'objectiu de millorar significativament els rendiments i les taxes de producció de la proteïna recombinant. Concretament es van obtenir increments importants de producció implementant tant condicions limitants d'oxigen com de deprivació de font de carboni en cultius de P. pastoris. De nou, s'hipotitza que aquests increments estan causats per la regulació del metabolisme central del carboni induïda per la resposta adaptativa de l'hoste a les noves condicions ambientals. Globalment, el resultat d'aquest estudi és una temptativa amb èxit d'aplicar el coneixement de la fisiologia de l'hoste d'expressió en el disseny racional d'estratègies de cultiu amb l'objectiu de maximitzar el rendiment i la productivitat de processos de producció de proteïnes recombinants explotant paràmetres claus del sistema que augmenten l'expressió de la proteïna. |
|---|