Systems metabolic engineering for recombinant protein production in Pichia pastoris
El llevat metilotròfic Pichia pastoris (Komagataella sp.) és un dels sistemes d'expressió més atractius per a la producció de proteïna recombinant, mercat contínuament en expansió. El fort promotor del gen de l'alcohol oxidasa 1 (PAOX1), induït per metanol però reprimit per glucosa, glicer...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:233860 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/233860 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Pichia Pastoris Lipases Proteïnes recombinants |
| Sumario: | El llevat metilotròfic Pichia pastoris (Komagataella sp.) és un dels sistemes d'expressió més atractius per a la producció de proteïna recombinant, mercat contínuament en expansió. El fort promotor del gen de l'alcohol oxidasa 1 (PAOX1), induït per metanol però reprimit per glucosa, glicerol o etanol, és un dels més emprats per aquest propòsit. No obstant, existeixen encara diversos colls d'ampolla fisiològics que limitant el procés.En aquest context, diferents estratègies han estat proposades i provades per tal de millorar la producció heteròloga de molts tipus diferents de proteïna. Les aproximacions més habituals inclouen increment en el nombre de còpies de gen heteròleg, enginyeria de promotors i modificació dels mecanismes de plegament i secreció. L'objectiu d'aquesta tesi ha estat el desenvolupament de noves estratègies per incrementar la producció de proteïna recombinant, emprant la lipasa de Rhizopus oryzae (Rol) com a proteïna model en el sistema d'expressió basat en el PAOX1.Primerament, els gens del factors de transcripció de PAOX1, MXR1 i MIT1, es van sobreexpressar constitutivament per tal de millorar la transcripció de ROL. Això es va confirmar degut a una millora en la capacitat assimilatòria de metanol i un increment en els nivells relatius de mRNA de ROL i varis gens relacionats amb el metabolisme del metanol, i.e. revertint l'efecte de titulació causat per la transcripció de múltiples cassettes d'expressió de ROL. Tot i aquestes millores, els nivells extracel·lulars d'activitat lipàsica no van augmentar de forma significativa en cultius en quimiòstat, apuntant a colls d'ampolla addicionals limitant la producció de Rol.En segon lloc, es van explorar possibles dianes d'enginyeria metabòlica en el metabolisme cel·lular de P. pastoris emprant el model metabòlic a escola genoma (GEM) consens iMT1026 v3.0. Aquest pas in silico va proporcionar diversos knock-outs prometedors que serien experimentalment testats fent servir el sistema d'edició genòmica CRISPR/Cas9. Les simulacions apuntaven a la disponibilitat de NADPH i una limitada aportació de determinats aminoàcids (serina i cisteïna) com a potencials factors limitants de la producció de Rol. Una reducció en el fitnes cel·lular que afecta a la viabilitat de les soques que es buscaven obtenir va impedir la verificació de la majoria dels knock-outs proposats.Finalment, donat que les nostres anàlisis i estudis prèviament publicats identificaven el NADPH com un cofactor important limitant la producció de proteïna recombinant, els nostres esforços es van dirigir a incrementar la seva disponibilitat a través d'estratègies de knock-in de gens. Específicament, vam sobreexpressar dos gens que codificaven per enzims redox, una NADH quinasa i una NADH oxidasa, amb l'objectiu de pertorbar directament l'equilibri redox de la cèl·lula. A més, es va comprovar l'efecte fisiològic d'aquests enzims fent servir diferents mescles co-substrat/metanol com a font de carboni. En resum, vam observar un increment en la producció de proteïna recombinant amb diferents graus de millora depenent de la font de carboni provada. També vam realitzar anàlisis transcriptòmiques i una avaluació in silico dels nostres resultats per tal de presentar una interpretació millor de l'estat fisiològic de la cèl·lula. Dins del nostre coneixement, aquest és el primer estudi dirigit a incrementar la generació de NADPH en un sistema d'expressió basat en PAOX1, en condicions de creixement en metanol.A grans trets, noves estratègies d'enginyeria de soques han estat proposades i provades durant l'execució d'aquest estudi. A més a més, s'han aplicat GEMs i aproximacions relacionades amb biologia de sistemes, demostrant que són eines potents i prometedores per al disseny racional d'organismes industrials. |
|---|