Bioprocess efficiency as a roadmap to establish Pichia pastoris as a reliable cell factory
El present document està centrat en un punt de vista d'enginyeria de bioprocés, de cara a la producció heteròloga de la lipasa de Rhizopus oryzae, expressada en el llevat metilotròfic Pichia pastoris sota el control del promotor de l'alcohol oxidasa 1, induïble amb metanol. Especialment, l...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2017 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:187714 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/187714 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Biotecnologia Pichia Pastoris Proteïnes recombinants |
| Sumario: | El present document està centrat en un punt de vista d'enginyeria de bioprocés, de cara a la producció heteròloga de la lipasa de Rhizopus oryzae, expressada en el llevat metilotròfic Pichia pastoris sota el control del promotor de l'alcohol oxidasa 1, induïble amb metanol. Especialment, l'objectiu es focalitza a la millora de l'eficiència del bioprocés mitjançant l'ús d'estratègies d'operació en discontinu alimentat en bioreactors de diferent escala. Amb això, es pretén establir P. pastoris com una plataforma versàtil, robusta i competent per a la producció de proteïnes recombinants. A la primera part de la tesi, l'èmfasi es troba en l'assoliment de nivells òptims dels principals índexs de rendiment d'interès industrial a escala de laboratori, utilitzant estratègies d'operació amb metanol com a font única de carboni i inductor del promotor. Prèviament a aquest objectiu, però, es van realitzar estudis preliminars i millores operacionals per tal de superar certes limitacions del sistema i per aportar-hi versatilitat i robustesa. Entre ells, es va actualitzar i incorporar millores al programa de supervisió i control del procés en LabVIEW, s'hi instal·là nou hardware d'instrumentació i es va implementar una nova estratègia d'alimentació de la font de nitrogen. Posteriorment, un estudi sistem àtic de l'efecte de la disponibilitat d'oxigen es va dur a terme. Es va obtenir que, en condicions de normòxia, l'oxigen dissolt pot limitar el procés tant per un excés com per nivells escassos. El 25 % de saturació d'aire es va establir com a valor òptim de cara a les velocitats específiques, i els resultats van ser validats per un test de consistència i reconciliació de dades. A partir d'aquest punt, s'assolí l'optimització del bioprocés a escala de laboratori mitjançant el disseny de perfils d'alimentació de metanol amb eines matemàtiques d'optimització. A partir de dades de modelització i amb una eina d'optimització simple i versàtil, es van dur a terme les simulacions de perfils òptims de concentració de metanol per maximitzar la concentració de producte i la productivitat volumètrica, es van comparar amb estratègies anteriors i es van aplicar experimentalment amb èxit. Per altra banda, la següent part del document se centra en estudis de canvi d'escala. El primer que es realitza és a escala de microbioreactor. Es van reproduir uns cultius realitzats a aquella escala al laboratori per verificar aquest sistema com a vàlid per realitzar-hi assajos d'expressió i selecció de soques i per dissenyar-hi estratègies simples d'operació en discontinu alimentat. Finalment, el bioprocés va ser portat a escala pilot de 50 L. Malauradament, els intents realitzats no van assolir reproduir l'eficiència del bioprocés, tot i que va ser possible descartar-ne algunes hipòtesis plantejades i proposarne d'altres que hauran de ser investigades en un futur, com ara limitacions en la transferència d'oxigen. |
|---|