Descripción de la ruta de asociación -via intercambio de segmentos- del dominio de unión a ADN del factor de transcripción humano FoxP1

El intercambio de segmentos (DS) corresponde a un mecanismo de oligomerización y plegamiento de proteínas, en el cual dos o más monómeros rompen contactos propios del estado nativo monomérico e intercambian parte de su estructura secundaria, restableciendo estos contactos de manera intermolecular al...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Medina González, Exequiel Antonio
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2017
País:Chile
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/209737
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/10533/209737
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Ciencias Naturales
Otras Ciencias Naturales
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description El intercambio de segmentos (DS) corresponde a un mecanismo de oligomerización y plegamiento de proteínas, en el cual dos o más monómeros rompen contactos propios del estado nativo monomérico e intercambian parte de su estructura secundaria, restableciendo estos contactos de manera intermolecular al alcanzar un estado dimérico u oligomérico entrelazado. Dada la necesidad de romper contactos propios del estado nativo del monómero, diferentes modelos de proteínas han mostrado que el tránsito hacia el dímero u oligómero vía DS depende de alcanzar previamente el estado desplegado. Esta importante restricción energética determina las propiedades termodinámicas y cinéticas características de la mayoría de las proteínas en las cuales ha sido demostrado este mecanismo, siendo la asociación vía DS fuertemente desfavorecida con respecto al estado monomérico. Los antecedentes recopilados en la literatura respecto a las proteínas de la subfamilia FoxP permitieron formular la hipótesis de este trabajo que consiste en que, a diferencia de la gran mayoría de las proteínas caracterizadas, los miembros FoxP no requerirían transitar por el estado desplegado en la reacción de asociación (o disociación), sino de un desplegamiento a nivel local. Mediante aproximaciones biofísicas se analizó el comportamiento cinético y termodinámico del intercambio de segmentos del dominio de ADN de FoxP1, hallando por un lado que la asociación de esta proteína está favorecida termodinámicamente entre 2-3 kcal·mol-1 respecto a otros modelos de intercambio de segmentos en un amplio intervalo de temperaturas. Además, se determinó que la disociación del dímero se ve favorecida debido a la formación de un intermediario monomérico con desplegamiento de regiones flexibles correspondientes a un 15% de la estructura nativa, que comprenden las hélices 1 y 5, y las hebras La ausencia de este intermediario monomérico en la mutante monomérica A39P descrita en la literatura, el aumento en la estabilidad en cerca de 2 kcal·mol-1 y la pérdida de flexibilidad de la hebra corroboran la hipótesis planteada. Otro aspecto importante se relaciona con el efecto de la interacción con el ligando (en este caso ADN) en las propiedades antes mencionadas. De esta forma, se estudió mediante la aproximación de fluorescencia por transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) la cinética de disociación de FoxP1 en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de DNA, observando que la presencia de DNA disminuye hasta en un 50% la velocidad de disociación, sin alterar la cantidad de dímero restante luego del alcanzar el equilibrio. Estos resultados muestran que el ligando promueve la estabilización del dímero y, ya que no afecta el valor de la constante de disociación, también disminuiría la velocidad de asociación del monómero, estabilizándolo también. Esto se corroboró en ensayos de esta tesis donde se observó unión monómero-ADN incluso en la proteína monomérica A39P. Finalmente, el análisis in singulo se realizó mediante FRET a nivel de molécula individual (smFRET) para intentar describir la heterogeneidad de conformaciones que dominan a la proteína en el intercambio de segmentos. Mediante la posición de fluoróforos (dador y aceptor) en diferentes posiciones del dímero, se encontró que al menos tres macro estados predominan en FoxP1: 1) una conformación de alto FRET cuya distancia entre fluoróforos coincide con lo predicho para el dímero por DS, 2) una conformación de bajo FRET mayoritaria que posee una distancia entre 20-25 Å más larga que la primera, que correspondería a una especie con al menos parte de la estructura extendida, y 3) una conformación intermedia entre las primeras dos. Sólo se observaron transiciones entre los estados 1 y 2 en la escala temporal de la medición. Ambos macro estados poseen cinéticas de interconversión cuya velocidad depende fuertemente de la región monitoreada por FRET, en particular determinando que en la interconversión observada para las regiones más flexibles descritas por HDX-MS, la especie más extendida está dramáticamente favorecida con respecto a la especie de DS, indicando que la flexibilidad local, a nivel de molécula individual, es responsable de las propiedades termodinámicas y cinéticas de la asociación de subunidades en FoxP1. Interesantemente, la presencia de ADN fue capaz de alterar el comportamiento de interconversión entre las conformaciones, favoreciendo el macro estado que coincide con el predicho para el intercambio de segmentos, indicando que estas condiciones también favorecen la asociación.
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spelling UNIVERSIDAD DE CHILEMedina González, Exequiel Antonio2017https://hdl.handle.net/10533/209737http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Otras Ciencias NaturalesCiencias NaturalesDescripción de la ruta de asociación -via intercambio de segmentos- del dominio de unión a ADN del factor de transcripción humano FoxP1Babul Cattan, JorgeUNIVERSIDAD DE CHILEChileMedina González, Exequiel Antonio2018-04-04T18:38:11Z2022-08-16T21:21:05Z2018-04-04T18:38:11Z2022-08-16T21:21:05Zinfo:eu-repo/date/embargoEnd/2019-01-012017El intercambio de segmentos (DS) corresponde a un mecanismo de oligomerización y plegamiento de proteínas, en el cual dos o más monómeros rompen contactos propios del estado nativo monomérico e intercambian parte de su estructura secundaria, restableciendo estos contactos de manera intermolecular al alcanzar un estado dimérico u oligomérico entrelazado. Dada la necesidad de romper contactos propios del estado nativo del monómero, diferentes modelos de proteínas han mostrado que el tránsito hacia el dímero u oligómero vía DS depende de alcanzar previamente el estado desplegado. Esta importante restricción energética determina las propiedades termodinámicas y cinéticas características de la mayoría de las proteínas en las cuales ha sido demostrado este mecanismo, siendo la asociación vía DS fuertemente desfavorecida con respecto al estado monomérico. Los antecedentes recopilados en la literatura respecto a las proteínas de la subfamilia FoxP permitieron formular la hipótesis de este trabajo que consiste en que, a diferencia de la gran mayoría de las proteínas caracterizadas, los miembros FoxP no requerirían transitar por el estado desplegado en la reacción de asociación (o disociación), sino de un desplegamiento a nivel local. Mediante aproximaciones biofísicas se analizó el comportamiento cinético y termodinámico del intercambio de segmentos del dominio de ADN de FoxP1, hallando por un lado que la asociación de esta proteína está favorecida termodinámicamente entre 2-3 kcal·mol-1 respecto a otros modelos de intercambio de segmentos en un amplio intervalo de temperaturas. Además, se determinó que la disociación del dímero se ve favorecida debido a la formación de un intermediario monomérico con desplegamiento de regiones flexibles correspondientes a un 15% de la estructura nativa, que comprenden las hélices 1 y 5, y las hebras La ausencia de este intermediario monomérico en la mutante monomérica A39P descrita en la literatura, el aumento en la estabilidad en cerca de 2 kcal·mol-1 y la pérdida de flexibilidad de la hebra corroboran la hipótesis planteada. Otro aspecto importante se relaciona con el efecto de la interacción con el ligando (en este caso ADN) en las propiedades antes mencionadas. De esta forma, se estudió mediante la aproximación de fluorescencia por transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) la cinética de disociación de FoxP1 en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de DNA, observando que la presencia de DNA disminuye hasta en un 50% la velocidad de disociación, sin alterar la cantidad de dímero restante luego del alcanzar el equilibrio. Estos resultados muestran que el ligando promueve la estabilización del dímero y, ya que no afecta el valor de la constante de disociación, también disminuiría la velocidad de asociación del monómero, estabilizándolo también. Esto se corroboró en ensayos de esta tesis donde se observó unión monómero-ADN incluso en la proteína monomérica A39P. Finalmente, el análisis in singulo se realizó mediante FRET a nivel de molécula individual (smFRET) para intentar describir la heterogeneidad de conformaciones que dominan a la proteína en el intercambio de segmentos. Mediante la posición de fluoróforos (dador y aceptor) en diferentes posiciones del dímero, se encontró que al menos tres macro estados predominan en FoxP1: 1) una conformación de alto FRET cuya distancia entre fluoróforos coincide con lo predicho para el dímero por DS, 2) una conformación de bajo FRET mayoritaria que posee una distancia entre 20-25 Å más larga que la primera, que correspondería a una especie con al menos parte de la estructura extendida, y 3) una conformación intermedia entre las primeras dos. Sólo se observaron transiciones entre los estados 1 y 2 en la escala temporal de la medición. Ambos macro estados poseen cinéticas de interconversión cuya velocidad depende fuertemente de la región monitoreada por FRET, en particular determinando que en la interconversión observada para las regiones más flexibles descritas por HDX-MS, la especie más extendida está dramáticamente favorecida con respecto a la especie de DS, indicando que la flexibilidad local, a nivel de molécula individual, es responsable de las propiedades termodinámicas y cinéticas de la asociación de subunidades en FoxP1. Interesantemente, la presencia de ADN fue capaz de alterar el comportamiento de interconversión entre las conformaciones, favoreciendo el macro estado que coincide con el predicho para el intercambio de segmentos, indicando que estas condiciones también favorecen la asociación.Three-dimensional domain swapping is a protein folding and oligomerization mechanism, in which two or more monomers break native monomeric contacts and exchange part of their secondary structure, reestablishing these contacts in an intermolecular fashion by reaching an intertwined dimer or oligomer. Due to the need of breaking contacts from the monomeric native state, different protein models have shown that the transition from monomer to domain-swapped dimer depends on previously reaching the unfolded state. This critical energetic restriction determines the thermodynamic and kinetic characteristics of most of these proteins, in which the domain swapping association is strongly disfavored compared with the monomeric state. Using biophysical approaches, the thermodynamic and kinetic behavior of domain swapping of the DNA-binding domain of the human FoxP1 was analyzed, finding that association is energetically favored by 2-3 kcal·mol-1 compared to most of the domain-swapped models in a wide range of temperatures. Moreover, it was determined that dimer dissociation (or monomer association) is promoted due to a highly structured monomeric intermediate with ~85% of native structure, showing an increased cooperativity in opening reactions in most flexible regions, spanning alpha-helices 1 and 5, and beta-strands 1,2 and 3. Absence of this intermediate in the monomeric mutant A39P, the increased conformational stability in ~2 kcal·mol-1 and the lowered flexibility in beta-strand 1 confirm the hypothesis of this thesis. Finally, analysis at single-molecule (sm) level were performed using FRET (smFRET) in order to describe the conformational heterogeneity of dimeric FoxP1. Through the use of donor and acceptor fluorophores in different positions of the dimer, it was found that at least three macro-states predominate: 1) a high-FRET conformation where donor and acceptor distances are in accordance with the domain-swapped dimer, 2) a highly populated low-FRET conformation where the donor and acceptor distances are 20-30 Å longer, which could represent a local unfolded species, and 3) a mid-FRET intermediate conformation between 1 and 2. Only transitions between 1 and 2 were determined, with both conformations exhibiting interconversion kinetics with rates constants that depend strongly on the fluorophore positions monitored by FRET, finding that in interconversion events monitored between more flexible regions, in accordance with the HDX-MS data, the local unfolded conformation is dramatically favored compared with the domain-swapped dimer. This local unfolding and flexibility are then responsible for the kinetics and thermodynamics of the FoxP1 association. Interestingly, in the presence of DNA, the local unfolded conformation is less populated at the expense of incrementing the domain-swapped population, indicating that under these conditions the ligand also promotes dimer formationFONDECYTAntecedentes expuestos en la tesis son parte de un trabajo cuya publicación se realizará este añoFONDECYT1130510https://hdl.handle.net/10533/209737instname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0info:eu-repo/grantAgreement//1130510info:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/Ciencias NaturalesOtras Ciencias NaturalesDescripción de la ruta de asociación -via intercambio de segmentos- del dominio de unión a ADN del factor de transcripción humano FoxP1Description of association via three-dimensional domain swapping (3D-DS) of the DNA-binding domain of human transcription factor FoxP1Tesis Doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionTesisTesishttps://hdl.handle.net/10533/209737FONDECYT1b6f3a2d-83bf-4aaa-b57a-0b4a62e5304bvirtual::56618-11b6f3a2d-83bf-4aaa-b57a-0b4a62e5304bvirtual::56618-1ORIGINALThesis_CRS_JBC rev_final2.pdfapplication/pdf4725948https://repositorio.anid.cl/bitstreams/73decd81-ed6b-41f5-9e3d-cdf06cc65864/download86bd64d4152f86e60a36da9575ff54f2MD51CC-LICENSElicense_rdfapplication/octet-stream1232https://repositorio.anid.cl/bitstreams/64cae001-04a6-4a44-9fde-3fe5dbdc9535/downloadf97bcfdf58f3e17b5cec231112dab5b1MD52LICENSElicense.txttext/plain1779https://repositorio.anid.cl/bitstreams/c63adc6d-a846-48ec-9701-47f81c7ec3b6/download593a6e7305c66c56041a9f9e15a649c1MD53TEXTThesis_CRS_JBC rev_final2.pdf.txtExtracted texttext/plain294002https://repositorio.anid.cl/bitstreams/1b9d5dbe-abac-4e83-9f9a-4bc282820be0/downloada0ae5526fd98da6ae91461b854417e03MD54THUMBNAILThesis_CRS_JBC rev_final2.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg2976https://repositorio.anid.cl/bitstreams/ecce4fcd-8c50-410f-8a43-ad2bfa8de97e/download3969a33f586b8430b9af2639fdbf3b5dMD5510533/209737oai:repositorio.anid.cl:10533/2097372023-07-24 03:45:34.21http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/info:eu-repo/semantics/embargoedAccesshttps://repositorio.anid.clRepositorio ANIDaletelier@anid.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