Descripción de la ruta de asociación -via intercambio de segmentos- del dominio de unión a ADN del factor de transcripción humano FoxP1
El intercambio de segmentos (DS) corresponde a un mecanismo de oligomerización y plegamiento de proteínas, en el cual dos o más monómeros rompen contactos propios del estado nativo monomérico e intercambian parte de su estructura secundaria, restableciendo estos contactos de manera intermolecular al...
| Autor: | |
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| Tipo de documento: | tese |
| Estado: | Versão publicada |
| Data de publicação: | 2017 |
| País: | Chile |
| OAI Identifier: | oai:repositorio.anid.cl:10533/209737 |
| Acesso em linha: | https://hdl.handle.net/10533/209737 |
| Access Level: | Acceso aberto |
| Palavra-chave: | Ciencias Naturales Otras Ciencias Naturales |
| Resumo: | El intercambio de segmentos (DS) corresponde a un mecanismo de oligomerización y plegamiento de proteínas, en el cual dos o más monómeros rompen contactos propios del estado nativo monomérico e intercambian parte de su estructura secundaria, restableciendo estos contactos de manera intermolecular al alcanzar un estado dimérico u oligomérico entrelazado. Dada la necesidad de romper contactos propios del estado nativo del monómero, diferentes modelos de proteínas han mostrado que el tránsito hacia el dímero u oligómero vía DS depende de alcanzar previamente el estado desplegado. Esta importante restricción energética determina las propiedades termodinámicas y cinéticas características de la mayoría de las proteínas en las cuales ha sido demostrado este mecanismo, siendo la asociación vía DS fuertemente desfavorecida con respecto al estado monomérico. Los antecedentes recopilados en la literatura respecto a las proteínas de la subfamilia FoxP permitieron formular la hipótesis de este trabajo que consiste en que, a diferencia de la gran mayoría de las proteínas caracterizadas, los miembros FoxP no requerirían transitar por el estado desplegado en la reacción de asociación (o disociación), sino de un desplegamiento a nivel local. Mediante aproximaciones biofísicas se analizó el comportamiento cinético y termodinámico del intercambio de segmentos del dominio de ADN de FoxP1, hallando por un lado que la asociación de esta proteína está favorecida termodinámicamente entre 2-3 kcal·mol-1 respecto a otros modelos de intercambio de segmentos en un amplio intervalo de temperaturas. Además, se determinó que la disociación del dímero se ve favorecida debido a la formación de un intermediario monomérico con desplegamiento de regiones flexibles correspondientes a un 15% de la estructura nativa, que comprenden las hélices 1 y 5, y las hebras La ausencia de este intermediario monomérico en la mutante monomérica A39P descrita en la literatura, el aumento en la estabilidad en cerca de 2 kcal·mol-1 y la pérdida de flexibilidad de la hebra corroboran la hipótesis planteada. Otro aspecto importante se relaciona con el efecto de la interacción con el ligando (en este caso ADN) en las propiedades antes mencionadas. De esta forma, se estudió mediante la aproximación de fluorescencia por transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) la cinética de disociación de FoxP1 en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de DNA, observando que la presencia de DNA disminuye hasta en un 50% la velocidad de disociación, sin alterar la cantidad de dímero restante luego del alcanzar el equilibrio. Estos resultados muestran que el ligando promueve la estabilización del dímero y, ya que no afecta el valor de la constante de disociación, también disminuiría la velocidad de asociación del monómero, estabilizándolo también. Esto se corroboró en ensayos de esta tesis donde se observó unión monómero-ADN incluso en la proteína monomérica A39P. Finalmente, el análisis in singulo se realizó mediante FRET a nivel de molécula individual (smFRET) para intentar describir la heterogeneidad de conformaciones que dominan a la proteína en el intercambio de segmentos. Mediante la posición de fluoróforos (dador y aceptor) en diferentes posiciones del dímero, se encontró que al menos tres macro estados predominan en FoxP1: 1) una conformación de alto FRET cuya distancia entre fluoróforos coincide con lo predicho para el dímero por DS, 2) una conformación de bajo FRET mayoritaria que posee una distancia entre 20-25 Å más larga que la primera, que correspondería a una especie con al menos parte de la estructura extendida, y 3) una conformación intermedia entre las primeras dos. Sólo se observaron transiciones entre los estados 1 y 2 en la escala temporal de la medición. Ambos macro estados poseen cinéticas de interconversión cuya velocidad depende fuertemente de la región monitoreada por FRET, en particular determinando que en la interconversión observada para las regiones más flexibles descritas por HDX-MS, la especie más extendida está dramáticamente favorecida con respecto a la especie de DS, indicando que la flexibilidad local, a nivel de molécula individual, es responsable de las propiedades termodinámicas y cinéticas de la asociación de subunidades en FoxP1. Interesantemente, la presencia de ADN fue capaz de alterar el comportamiento de interconversión entre las conformaciones, favoreciendo el macro estado que coincide con el predicho para el intercambio de segmentos, indicando que estas condiciones también favorecen la asociación. |
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