Clonación y expresión de la conotoxina recombinante cal26a de Conus californicus en Escherichia coli
Las conotoxinas son péptidos de longitud menor a 50 aminoácidos, ricos en enlaces disulfuro, las cuales son producidas por los caracoles del género Conus y empleados para paralizar a sus presas como estrategia de defensa y/o alimentación. Estos péptidos son ligandos de diferentes blancos moleculare...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2015 |
| País: | México |
| Institución: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/657 |
| Acceso en línea: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/657 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | info:eu-repo/classification/Autor/Conotoxinas info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Sumario: | Las conotoxinas son péptidos de longitud menor a 50 aminoácidos, ricos en enlaces disulfuro, las cuales son producidas por los caracoles del género Conus y empleados para paralizar a sus presas como estrategia de defensa y/o alimentación. Estos péptidos son ligandos de diferentes blancos moleculares, entre los que se encuentran canales iónicos y receptores membranales. Como consecuencia de su gran afinidad y especificidad a su blanco molecular, estas toxinas representan una fuente potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. El estudio de las conotoxinas se ve limitado por la dificultad que representa su obtención por vías naturales, ya que se requiere de la disección de una gran cantidad de especímenes para recabar suficiente material biológico para su análisis. Una alternativa a esto es la producción de proteínas recombinantes, la cual se basa en la clonación del gen que codifica para la conotoxina y su producción en sistema de expresión así como su posterior purificación. En este proyecto se plantea como objetivo obtener la conotoxina cal26a de manera recombinante en E. coli para su análisis de actividad, así como para su posterior empleo en estudios de estructura y caracterización de blancos moleculares, entre otros. Para lo cual se diseñaron cinco construcciones empleando el vector pET-22b (+), cal26a-His, His-cal26a1-2 y His-SP-cal26a1-2, para su expresión con la cepa BL21 (DE3). Solo cal26aHis fue expresado en cantidades suficientes para su evaluación, pero permaneció unido al péptido señal (pelB) y formó cuerpos de inclusión. Los agregados fueron aislados y cal26a-Hisr purificada en condiciones desnaturalizantes, obteniendo un rendimiento de 1.19 mg/L. La proteína recombinante fue replegada en columna de Ni-NTA mediante dos soluciones renaturalizantes, Tris-HCl 20 mM y Tris-HCl 20mM adicionado con glicina 10 mM. Un ensayo preliminar de actividad contra M. tuberculosis mostró una tendencia de inhibición del crecimiento, donde cal26a-Hisr renaturalizado con glicina pl_8 µg/mL redujo la actividad en un 20 % en comparación con el control, sin embargo estudios posteriores deben ser realizados para corroborar su actividad. |
|---|