Isolation and characterization of heavy chain single-domain antibodies from the horn shark Heterodontus francisci against murine CD38
Además de los anticuerpos convencionales, los tiburones desarrollaron anticuerpos compuestos por la cadena polipeptídica pesada denominados IgNAR, el fragmento variable de éstos se designa como vNAR y constituye los dominios de anticuerpo más pequeños capaces de reconocer a un antígeno. El largo inu...
| Autor: | |
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| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2011 |
| País: | México |
| Recursos: | Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada |
| Repositorio: | Repositorio Institucional CICESE |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:cicese.repositorioinstitucional.mx:1007/594 |
| Acesso em linha: | http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/594 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | info:eu-repo/classification/Autor/IgNAR,Heterodontus francisci,Tiburón toro,CD38,Ciencias del mar info:eu-repo/classification/cti/2 info:eu-repo/classification/cti/24 info:eu-repo/classification/cti/2414 |
| Resumo: | Además de los anticuerpos convencionales, los tiburones desarrollaron anticuerpos compuestos por la cadena polipeptídica pesada denominados IgNAR, el fragmento variable de éstos se designa como vNAR y constituye los dominios de anticuerpo más pequeños capaces de reconocer a un antígeno. El largo inusual de su CDR3, les permite penetrar en las cavidades de los sitios activos de las enzimas e inhibirlas. Considerando esta característica, uno de los objetivos de este proyecto consistió en aislar anticuerpos de dominio sencillo del tiburón Heterodontus francisci, a partir de una biblioteca inmune específica, capaces de unirse a la enzima CD38 murina. La proteína CD38 actúa como receptor en la sinapsis inmunológica, y como enzima está involucrada en la degradación extracelular del NAD+ . Clínicamente esta proteína se utiliza como marcador de prognosis en la Leucemia Linfocítica Crónica. En este proyecto se generaron y aislaron vNARs que específicamente se unen a CD38 murino. A partir de un tiburón inmunizado se obtuvo una biblioteca de vNARs altamente diversa, después de varias rondas de selección se aislaron 16 familias. Las proteínas recombinantes así como los fago-anticuerpos fueron utilizados para probar su actividad de reaccionar específicamente contra CD38 en un ensayo de ELISA, los resultados revelaron que todas las familias con excepción de una eran capaces de unirse a CD38. A pesar de esto, ninguno de los vNARs aislados fue capaz de inhibir la actividad hidrolítica de la enzima. Se realizaron ensayos de FACS sobre células que expresaban CD38 en su membrana, como células de bazo de ratón y células de linfoma. De esta forma se identificó que los vNAR tenían una capacidad baja de unirse a células de bazo de ratón, pero se unían de manera favorable a las células de linfoma EL4-R (CD38pos). Hasta el momento se sabe que la familia SAGTK es la que mejor reacciona contra la enzima CD38 de ratón. El segundo objetivo del proyecto, fue generar anticuerpos capaces de reconocer moléculas de tipo vNAR, para ello se inmunizaron tres ratones con un vNAR purificado. Los ratones inmunizados desarrollaron una respuesta inmune específica, por lo que se utilizó el bazo y los nodos linfñaticos de uno de ellos para generar anticuerpos monoclonales. De la fusión celular se aislaron clonas capaces de reconocer una variedad de vNARs, después de subclonar las células fusionadas, se aislaron los anticuerpos monoclonales 370 y 533 ambos con un isotipo IgG1k. Usando los anticuerpos monoclonales (MAb) #379 y #533 en ensayos de ELISA y dot blot, se detectó específicamente diferentes vNARs y suero de tiburón. Además se evaluó si ambos MAb eran capaces de detectar alguna molécula presente en el suero del tiburón H. francisci, demostrándose que una molécula de aproximadamente 80 kDa fue inmuno-precipitada y detectada por Western blot utilizando el MAb 370. Otras dos proteínas del suero de tiburón fueron precipitadas, pero no detectadas por western blot, la primera con un peso molecular de 160 kDa y la segunda con un peso entre los 160 y 260 kDa. Todas estas moléculas están actualmente siendo analizadas por espectometría de masas para identificar la naturaleza de cada una de ellas, hasta la fecha se tiene la secuencia parcial de la proteína de 80 kDa que se confirmó como un IgNAR de H. francisci. Por otro lado, los MAbs 370 y 533 se utilizaron para determinar si en el curso de una inmunización de un tiburón H. francisci existían cambios en la especificidad del suero con el antígeno utilizado. Los resultados obtenidos utilizando el MAb 370 como método de detección en un ensayo de ELISA, muestran que después de 10 días posteriores a la inmunización, existe un reconocimiento específico al antígeno, dicha señal alcanza su punto más alto entre los días 26 y 40. Se demostró también que ante la falta de la administración de antígeno, la respuesta específica disminuye e incrementa de forma rápida ante una nueva administración. Los resultados obtenidos hasta ahora representan el primer acercamiento para investigar si existe una respuesta antígeno específica durante los procesos de inmunización del tiburón H. francisci y para determinar si existe maduración de la afinidad de los anticuerpos mediante un proceso dirigido por el antígeno. |
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