Identificación de proteínas que se unen a coumestrol en la membrana de enterocitos de yeyuno en ratón adulto CD1

El proceso reproductivo de los animales requiere de la energía que se obtiene de los alimentos. Sin embargo, en ellos también pueden estar presentes compuestos que interfieren potencialmente con la fisiología y control de la reproducción. Tal es el caso de los fitoestrógenos, compuestos de origen ve...

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Detalles Bibliográficos
Autor: PABLO LEON ORTIZ
Tipo de recurso: tesis de maestría
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2014
País:México
Institución:Universidad Autónoma Metropolitana
Repositorio:Repositorio Institucional de la UAM Iztapalapa
Idioma:español
OAI Identifier:oai:bindani.izt.uam.mx:5138jf05g
Acceso en línea:https://doi.org/10.24275/uami.5138jf05g
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:info:eu-repo/classification/LEM/Functional foods
info:eu-repo/classification/LEM/Phytoestrogens Physiological effect
info:eu-repo/classification/LEM/Coumestrol
info:eu-repo/classification/LEM/Fitoestrógenos
info:eu-repo/classification/LEM/Reproducción animal
info:eu-repo/classification/LEM/Tecnología reproductiva humana
info:eu-repo/classification/LEM/Human reproductive technology
info:eu-repo/classification/LEM/Phytoestrogens
info:eu-repo/classification/LEM/Alimentos funcionales
info:eu-repo/classification/cti/6
Descripción
Sumario:El proceso reproductivo de los animales requiere de la energía que se obtiene de los alimentos. Sin embargo, en ellos también pueden estar presentes compuestos que interfieren potencialmente con la fisiología y control de la reproducción. Tal es el caso de los fitoestrógenos, compuestos de origen vegetal estructuralmente similares a las hormonas esteroides con capacidad de interactuar con los receptores a estrógenos (ERs) y promover o inhibir la respuesta fisiológica a los estrógenos. Una de las funciones características de las membranas celulares es la permeabilidad selectiva que permite el intercambio controlado de substratos iones y moléculas específicas. En la membrana de las células existen varias proteínas encargadas de transportar y facilitar el movimiento de moléculas lipófilicas, como colesterol, vitaminas A, D o polifenoles. Ejemplos de ellas son, la proteína transportadora NPC1L1, SR-B1, la translocasa de grasas CD36, además de cuatro miembros de la familia de proteínas transportadoras caracterizadas por tener un casete de unión a ATP: ABCA1, ABCG1, ABCG5 y ABCG8. En el suero y líquido intercelular, se presentan otro tipo de proteínas capaces de unir compuestos lipofílicos incluyendo la globulina que une hormonas sexuales estradiol y testosterona (SHBG), la globulina de unión de corticosteroides (CBG) y la globulina unidora de tiroxina (TBG). Además de estos transportadores específicos, algunos otros como, la albúmina son capaces de unir una amplia variedad de compuestos incluyendo esteroides, diferentes fitoquímicos y xenobióticos. El transporte a través del epitelio intestinal del Coumestrol se ha tomado como un proceso equivalente e incluso similar al de las substancias lipófilicas como el colesterol. Aunque, no hay evidencias de que esto sea cierto. El objetivo del presente estudio fue identificar la presencia de componentes proteicos aislados de las membranas celulares de los enterocitos de ratón adulto CD1 con capacidad de unirse al coumestrol de manera aislada. Se diseñaron y optimizaron varias metodologías que permitieran obtener e identificar a este tipo de proteínas. Se utilizaron 20 ratones a los cuales se les extrajo la porción del yeyuno del intestino delgado; después de hacer una inversión del túbulo intestinal para exponer los enterocitos, se separó el material en digestión y el recubrimiento de mucina. La separación mecánica del epitelio se realizó en amortiguador con citrato de sodio. Los enterocitos se obtuvieron por digestión del epitelio con colagenasa. Las proteínas de membrana se solubilizaron con Triton X100. El detergente se retiró precipitando las proteínas totales con acetona fría. Las proteínas precipitadas se reconstituyeron en micelas de duodecilsulfato de sodio y se separaron electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 8%. La detección de las proteínas que se unen al coumestrol, se realizó utilizando una solución metanólica al 50 % con Coumestrol 50 μg/mL. Las proteínas que unen coumestrol con menor afinidad permanecen visibles al retirar el exceso con metanol. Aquellas que lo hacen con mayor eficiencia permanecen visibles, a pesar de emplear ácido acético al 10%. Para establecer la complejidad de la membrana del enterocito, los mismos geles fueron teñidos con azul de Coomassie y con nitrato de plata. Utilizando esta metodología se detectaron una gran cantidad de proteínas que pueden unir de manera inespecífica al coumestrol. Aún en la preparación comercial de albúmina sérica bovina fracción V del método de Cohn se observan al menos 2 números de componentes una vez que se ha retirado el exceso de coumestrol con el solvente primario. Si se rehidrata el gel con amortiguador o agua, la unión se conserva. Esta unión enmascara la unión más fuerte que tiene una proteína con peso molecular relativo (MWr) de 24,594 Daltones a la que hemos denominado p25. Está proteína puede visualizarse cuando se deja el gel teñido con coumestrol en una solución de ácido acético al 10%. La banda de proteínas identificada presenta un peso molecular totalmente distintivas que no permiten asociarlas con aquellas que se han reportado asociadas al transporte de colesterol, vitaminas liposolubles o mediando la saturación lipídica de las lipoproteínas del tipo de las LDL. Mientras que la proteína NPC 1L1 tiene un peso molecular de 146.6 kDa, la CD36 88 kDa y la SR-B1 de 80 kDa. De la misma forma, la diversidad en la localización de los diferentes transportadores no permite una asociación específica; mientras que NPC1 es la principal reguladora de lípidos en la membrana celular de los enterocitos y la membrana canalicular de los hepatocitos, otros transportadores son intracelulares; el enclave de la proteína p25 está restringida a la membrana celular como lo indica el uso de concentraciones importantes de detergente utilizado para su extracción. La identificación de una banda de proteínas abre la posibilidad de realizar estudios específicos de proteómica tanto estructural como funcional.

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