Optimització del protocol per a la vitrificació d'oòcists bovins madurats in vitro|Optimización del protocolo para la vitrificación de ovocitos bovinos madurados in vitro|Optimizing the protocol for the vitrification of in vitro matured bovine oocytes
La criopreservació d’oòcits i embrions de mamífers s’ha convertit en una part integral de la reproducció assistida tant en humans com en espècies veterinàries. No obstant això, els mètodes utilitzats per a criopreservar oòcits i embrions bovins encara mostren deficiències. Mitjançant l’ús de princip...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2021 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/674028 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/674028 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Criopreservació Criopreserservación Cryopreservation Oòcit Ovocito Oocyte Boví Bovino Bovine Ciències de la Salut 577 |
| Sumario: | La criopreservació d’oòcits i embrions de mamífers s’ha convertit en una part integral de la reproducció assistida tant en humans com en espècies veterinàries. No obstant això, els mètodes utilitzats per a criopreservar oòcits i embrions bovins encara mostren deficiències. Mitjançant l’ús de principis fonamentals i models informàtics, les estimacions dels mètodes òptims es poden aconseguir mitjançant una anàlisi racional, amb el potencial d’estalviar una quantitat significativa de recursos en reduir les opcions per a provar mitjançant mètodes empírics. No obstant això, molts dels formalismes de transport que s’utilitzen actualment es basen en suposicions limitants de solució diluïda, sovint apropiades en condicions fisiològiques, però rares vegades adequades en criobiologia, on els crioprotectors s’utilitzen sovint en concentracions elevades. Per tant, el primer objectiu d’aquest treball va ser examinar els efectes de l’augment de les concentracions de CPA sobre la permeabilitat a l’aigua i al CPA en oòcits bovins immadurs i madurats in vitro a través de dos enfocaments matemàtics: el formalisme 2P i el formalisme no diluït. Els resultats van mostrar que la concentració de CPA va afectar la permeabilitat de la membrana del CPA, amb efectes diferencials segons l’etapa de maduració de l’oòcit i el tipus específic de CPA. A més, quan es van comparar els dos enfocaments de modelatge, el primer utilitzant supòsits de solució diluïda i el segon no restringit a aquests supòsits, els resultats mostraren que només existien lleugeres diferències entre les prediccions dels dos models durant els passos d’addició de CPA, i una major diferència durant la primera etapa d’eliminació de CPA. Pel fet que les solucions de vitrificació contenen una alta concentració de crioprotectors, la permeabilitat de la membrana plasmàtica es converteix en un aspecte important per a minimitzar la toxicitat dels CPAs. En conseqüència, el segon objectiu va ser estudiar el paper de les aquagliceroporines en el moviment d’aigua i CPAs en oòcits MII bovins. Els nostres resultats van demostrar que els oòcits bovins MII van expressar AQP3 i AQP7 però no AQP9 quan es van exposar a una solució hiperosmòtica amb l’expressió d’AQP3 regulada a l’alça després de l’exposició a Me2SO, i de l’AQP7 després de l’exposició a EG. A més, també vam demostrar que l’expressió exògena d’AQP7 és possible en oòcits madurats in vitro, i sembla facilitar la difusió d’aigua quan els oòcits bovins MII es troven en presència de solucions de sacarosa o Me2SO però no de EG. No obstant això, aquesta acuaporina no està involucrada en el moviment de Me2SO i EG. Finalment, es va avaluar l’eficiència del model teòric resultant del primer estudi. Basant-nos en observacions osmòtiques in silico i in vitro, vam proposar protocols de deshidratació més curts a diferents temperatures (25°C enfront de 38.5°C) com un primer pas cap a la definició d’un mètode de criopreservació òptim. Les observacions in vitro del comportament osmòtic dels oòcits van indicar que el temps necessari perquè els oòcits aconsegueixin el volum cel·lular d’equilibri després de l’exposició a la solució d’equilibri estàndard va ser de 2 min 30 s a 38.5°C i de 5 min 30 s a 25°C. Posteriorment , vam provar l’eficiència dels temps d’exposició optimitzats per a cèl·lules específiques per a cada temperatura abans de la vitrificació/escalfament en la configuració del fus meiòtic dels oòcits, la fragmentació de l’ADN i el desenvolupament embrionari. Com a resultat, vam poder reduir amb èxit el temps necessari per a preparar oòcits bovins per a la vitrificació a 2 min 30 s quan la vitrificació es va realitzar a 38.5°C, obtenint resultats similars en morfologia del fus, fragmentació de l’ADN i desenvolupament embrionari que els oòcits de control frescos. |
|---|