| Sumario: | En els últims 20 anys, la caracterització de proteines de membrana ha esdevingut un camp interessant per el disseny de fàrmacs però, la falta d'informació del seu mecanisme d'acció i estructura fa encara més difícil buscar noves dianes terapèutiques. Per tant, estudiar l'estructura i el mecanisme d'acció de proteines de membrana acceleraria la recerca de nous fàrmacs i les seves implicacions mèdiques. El projecte de tesis presentat aquí està centrat en explorar les característiques del transprotador de glucosa humà (hSGLT1). Aquest transportador està implicat en la absorció de glucosa intestinal i està relacionat directament amb diferents enfermetats com: glucosa galactose malabsorbation (GGM), diabetis i l'enfermetat d'Alzheimer. El mecanisme de funcionament d'aquest transportador esta parcialment caracteritzat malgrat que algunes característiques encara no estan clares i s'estan estudiant. No obstant, l'estructura tridemensional del transport no esta descrita i, actualment, és el màxim objectiu pel que fa a entendre com funciona el seu mecanisme i que permetria buscar més fàcilment i efectivament nous fàrmacs. Inicialment, per tal d'obtenir un cristall de proteïna per poder resoldre la seva estructura, es necessiten un gran número de pasos previs. Primer, la proteina d'interest ha de ser expressada en un sistema recombinant correctament i, les proteïnes de membrana no són fàcils d'expressar en tots els sistemes d'expressió. En segon lloc, les proteïnes de membrana humanes son encara més complicades d'expressar perquè es necessari treballar en un sistema d'expressió eucariote o, sinó, es molt probable que s'obtingui una proteïna funcionalment inactiva. hSGLT1 ha sigut obtingut recombinant només un cop per un sistema eucariote de llevat: Pichia pastoris. Aquest llevat ha sigut utilitzat en els últims 10 anys per expressar proteines de membrana perque, a diferència d'altres llevats, com Saccharomyces cerevisae, pot crèixer molt més i, per tant, obtenir molta més proteïna. Una altre avantatge d'aquest sistema d'expressió és l'estabilitat dels clons de P. pastoris ja que implica més reproducibilitat en l'expressió. Tot i així, algunes desavantatges presenta aquest sistem que s'han de superar per tal d'obtenir bons nivells d'epressió, com per exemple, la selecció de clons. Degut a tot aixó, el projecte que es presenta aquí esta basat inicialment amb els treballs previs realitzats amb P. pastoris. Aquesta tesis esta centrada en l'expressió, purificació i caracterització del transportador de glucosa humà (hSGLT1) expressat en un sistema d'expressió heteroluga de llevat (P.pastoris). Inicialment, dos vectors es van dissenyar: Un que expressa hSGLT1 fusionat amb eGFP i l'altre que no (WT). El constructe que expresa la proteina fusionada amb eGFP es va utilitzar per monotiroritzar l'expressió de manera més fàcil i ràpida i que, per tant, permet optimitzar les condicions d'expressió, com per exemple: temps d'inducció, temperature, medis.etc. Les proteines de membrana necessiten ser extrete de la membrana per poder-les purificiar i, per tant, es requereix de detergent. El constructe amb eGFP es va utilitzar també per buscar quin detergent era més òptim per extreure la proteïna. Tot i així, tots ambdós costructes (WT i eGFP) es van purificar i aïllar correctament però només el producte WT es va utilitzar per els següents experiments estructurals. Malgrat les dificultats de reproduir el que s'havia descrit anteriorment, la proteina finalment es va aconseguir sotmetre a assaijos de funcionalitat. L'assaig de binding es va fer a partir d'una tècnica inusual: voltage-clamp in planar lipid membranes. Aquesta tècnica permet mesurar transport (funció) del transportador sense la necessitat d'incorporarar-la en liposomes. La conclusió final que es pot extreure en aquest treball es que hSGLT1 es pot purificar correctament i que, per tant, obre un gran ventall de possibilitats en un futur, com per exemple, cristalitzar la proteina per tal de resoldre la seva estructura i el seu mecanisme.
|
|---|
