Developing strategies for systems metabolic engineering of Pichia pastoris
Pichia pastoris s'ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més utilitzades per a la producció de proteïnes recombinants i metabòlits d'alt valor afegit. En els darrers anys s'han aconseguit fites importants en l'anàlisi quantitativa a nivell de sistemes de la seva fisiol...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2017 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:188063 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/188063 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Pichia Pastoris Proteines recombinants |
| Sumario: | Pichia pastoris s'ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més utilitzades per a la producció de proteïnes recombinants i metabòlits d'alt valor afegit. En els darrers anys s'han aconseguit fites importants en l'anàlisi quantitativa a nivell de sistemes de la seva fisiologia. Aquesta gran quantitat d'informació ha permès desenvolupar models metabòlics a escala genòmica, que permeten el desenvolupament de noves estratègies per l'enginyeria de soques i de bioprocés. Amb anterioritat a aquest estudi s'havien publicat tres models metabòlics a escala genòmica per a P. pastoris. No obstant això, aquests models presentaven algunes inconsistències en algunes vies metabòliques, en la nomenclatura de metabòlits i reaccions, així com les anotacions associades a certes vies. A més, algunes de les rutes metabòliques o característiques específiques de P. pastoris eren representades de forma errònia o incompleta. És per això que en aquest estudi es desenvolupa un model metabòlic a escala genòmica consens, que integra els models anteriors. A més, també es fa una revisió exhaustiva de diverses rutes metabòliques i nombroses vies es corregeixen i actualitzen d'acord amb les publicacions disponibles. Com a resultat, el nou model, iMT1026, pot reproduir amb més precisió els paràmetres de creixement experimentals de cèl·lules creixent en glucosa i diferents nivells de disponibilitat d'oxigen. Amb la voluntat d'expandir les capacitats del model, es generen noves dades fisiològiques fent servir dos dels substrats més importants per aquesta factoria cel·lular. Es realitzen unes series de cultius en continu per a la caracterització del perfil fisiològic de P. pastoris creixent en glicerol i metanol com a fonts úniques de substrat. A més, també es caracteritza la composició macromolecular de la biomassa. Posteriorment, s'incorporen en el model noves equacions de biomassa específiques per a cada font de carboni. Aquestes noves dades experimentals han permès estimar els paràmetres energètics associats a les fonts de carboni i validar el model (iMT1026 v3.0) per aquestes condicions de creixement. Tot i la validació de iMT1026 v3.0 en un rang més ampli de condicions, en aquest treball es prova en dues aplicacions diferents: en l'anàlisi de fluxos metabòlics basat en 13C i com a eina de suport per a la interpretació de resultats en soques amb modificades en el metabolisme redox. Tot i que hi ha un únic estudi on s'analitza la relació entre fluxos metabòlics en cèl·lules creixent en glicerol, no es té constància de cap estudi d'anàlisi de fluxos metabòlics en aquesta font de carboni. Així doncs, es redueix el model metabòlic a escala genòmica a un model del metabolisme central i es fa servir per a l'anàlisi de fluxos metabòlics basats en 13C en cèl·lules creixent amb glicerol a diferents velocitats de creixement. Els resultats obtinguts són molt consistents amb els cultius previs en glicerol. També s'utilitza iMT1026v3.0 com a suport per a la interpretació del perfil fisiològic obtingut en soques amb el metabolisme redox modificat. Una soca que expressa un fragment d'anticòs es modifica genèticament mitjançant l'expressió d'una NADH quinasa, de manera que el balanç de cofactors redox queda pertorbat. Les soques generades mostren una producció de proteïna recombinant més elevada i una alteració en el perfil macroscòpic de creixement. Mitjançant l'anàlisi in silico dels perfils fisiològics resultants, es prediuen possibles canvis metabòlics associats a l'alteració del balanç de cofactors que estan d'acord amb el perfil macroscòpic observat. Així doncs, en línies generals, en aquest treball es desenvolupa una eina precisa per a l'enginyeria de sistemes metabòlics. A més, és validada en condicions vàries i s'utilitza en dues aplicacions diferents que demostren la seva fiabilitat. |
|---|