Physiological control of Pichia pastoris for the production of recombinant proteins
En una primera etapa de la present tesi, es va dur a terme una caracterització de l'efecte de la limitació d'oxigen (hipòxia) sobre la producció recombinant de la lipasa 1 de Candida rugosa (Crl1) mitjançant cultius en continu amb dos clons diferents de P. Pastoris, un que disposava d'...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2023 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:293584 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/293584 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Pichia pastoris Hipòxia Hypoxia Hipoxia Control de bioprocessos Bioprocess control Control de bioprocesos Ciències Experimentals Tecnologies |
| Sumario: | En una primera etapa de la present tesi, es va dur a terme una caracterització de l'efecte de la limitació d'oxigen (hipòxia) sobre la producció recombinant de la lipasa 1 de Candida rugosa (Crl1) mitjançant cultius en continu amb dos clons diferents de P. Pastoris, un que disposava d'una còpia del gen CRL1 (single-copy clone o SCC) i un altre que en disposava de 5 còpies (multicopy clone o MCC). Es van provar diferents graus de limitació d'oxigen variant la concentració d'oxigen en el gas d'entrada, definit aquelles condicions que es consideraven òptimes en termes de producció de Crl1 i que no comprometien significativament el creixement del llevat. Les velocitats específiques de producció (qP) van ser fins a 2 vegades més grans en hipòxia que en normòxia (condicions completament aeròbiques), tot i que aquest increment de producció de Crl1 va resultar més important per al SCC que per al MCC. Addicionalment, es va definir el Quocient Respiratori (RQ) com a variable per a controlar el nivell de limitació d'oxigen, ja que aquesta és una variable que depèn només de l'estat fisiològic de la biomassa, i per tant, es pot utilitzar com a variable indicadora a l'hora d'implementar el mateix grau d'hipòxia en un altre equip o mode d'operació. Posteriorment, un cop definides les condicions de limitació d'oxigen òptimes, es van replicar aquestes condicions en fed-batch. Els resultats obtinguts van ser similars als obtinguts en quimiòstat, duplicant la qP del SCC en condicions d'hipòxia i obtenint, però, un increment menor en el cas del MCC. A més, els resultats van ser corroborats gràcies a un estudi de transcriptòmica dels gens relacionats amb la producció de Crl1 mitjançant qPCR. Per finalitzar aquesta primera etapa de la tesi, es va dur a terme dues fermentacions a escala pilot, utilitzant el RQ com a criteri de canvi d'escala per tal d'aplicar les mateixes condicions d'hipòxia, obtenint una producció de Crl1 lleugerament més baixa que a escala laboratori però validant l'estratègia de limitació d'oxigen i la utilització del RQ com a paràmetre de control transferible entre diferents sistemes experimentals. La segona etapa de la tesi va consistir en millorar el controlador de RQ en fed-batch, que inicialment estava basat en la modificació manual i intermitent de la velocitat d'agitació per tal d'augmentar o disminuir la transferència d'oxigen al medi de cultiu (control manual-heurístic). Es van establir dues estratègies de control de RQ sofisticades. La primera va ser dissenyada, programada i desenvolupada a través del software Eve, el qual va permetre la implementació de soft sensors per tal de fer un càlcul precís i acurat del RQ i actuar sobre la velocitat d'agitació de forma automàtica. D'altra banda, la segona va consistir en un controlador proporcional adaptatiu, en què el valor del paràmetre proporcional del controlador s'anava actualitzant a cada minut de la fermentació basant-se en la predicció d'un model d'intel·ligència artificial (IA), i va ser dissenyada conjuntament en col·laboració amb membres de l'empresa AIZON, que van ser qui en van programar el codi. Aquesta estratègia ha esdevingut una prova de concepte per demostrar com es pot utilitzar la IA per a dur a terme el control automàtic de bioprocessos. Finalment, com a últim capítol de la tesi, l'estratègia hipòxica es va provar amb dues soques de P. Pastoris més, expressant dues proteïnes diferents: la lipasa de Rhizopus oryzae (proRol) i la lipasa B de Candida antarctica (CalB), dues lipases amb interès industrial. Les millores de producció obtingudes en aplicar condicions hipòxiques van ser equiparables a les obtingudes amb la producció de Crl1, validant així l'estratègia hipòxica per a la millora de producció de proteïnes recombinants. |
|---|