Combining bioprocess and strain engineering strategies as efficient tools for the optimization of recombinant protein production in Pichia pastoris
Les factories cel·lulars microbianes poden ser utilitzades per produir un ampli rang de bioproductes d'interès per a la biotecnologia industrial, els quals comprenen principalment la producció de proteïnes recombinants i metabòlits. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emergeix com un hostatg...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2020 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/670163 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/670163 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Enginyeria de bioprocés Ingeniería de bioprocesos Bioprocess engineering Pichia pastoris Enginyeria de soques Ingeniería de cepas Strain engineering Tecnologies 66 |
| Sumario: | Les factories cel·lulars microbianes poden ser utilitzades per produir un ampli rang de bioproductes d'interès per a la biotecnologia industrial, els quals comprenen principalment la producció de proteïnes recombinants i metabòlits. Pichia pastoris (Komagataela phaffii), emergeix com un hostatger prometedor per a la producció de proteïna recombinant (RPP) ja que comparteix moltes característiques amb Saccharomyces cerevisiae, però, mostra avantatges en relació amb el consum d'oxigen, tenir un patró de glicosilació més simple, i una menor secreció de proteïnes endògenes. Per aquestes raons, s'han realitzat grans esforços amb l'objectiu d'optimitzar l'eficiència d'aquest hostatger, els quals poden agrupar-se en dos principals i complementaris enfocaments: l'enginyeria de soques i bioprocés. La present tesi doctoral es va basar en l'ús de tots dos enfocs per tal de millorar bioprocessos de producció de lipases recombinants amb interès industrial. En primer lloc, es va demostrar la importància del coneixement de les cinètiques de producció com una potent eina per al disseny d'estratègies òptimes en la RPP a través de la caracterització de dos clons amb un diferent comportament, a causa de la seva diferent dosi gènica, expressant la lipasa 1 de Candida rugosa sota la regulació del promotor GAP (PGAP) duent a terme cultius en quimiòstat i fed-batch. Els resultats, també justificats mitjançant anàlisi transcripcional de diversos gens clau com important novetat, van demostrar que la cinètica de producció depèn de les característiques intrínseques de cada clon usat. D'aquesta manera, la selecció d'una μ adequada per a cada cas permet, d'una manera diferent, un desenvolupament racional del procés per poder optimitzar els bioprocessos RPP. Després, es va avaluar la potencial implementació de la deprivació de carboni (carbon-starving) com una innovadora estratègia que millori les velocitats de producció i rendiments de Crl1 en cultius fed-batch amb una prèvia caracterització fisiològica per a cultius en quimiòstat. Els resultats van evidenciar que l'efecte positiu d'utilitzar aquesta estratègia és altament depenent de les particularitats intrínseques del clon utilitzat. Es va realitzar una anàlisi transcripcional addicional (RNAseq) sobre mostres de quimiòstat, ressaltant la diferència en la transcripció per a tots els gens del llevat. A més, el comportament del bioprocés durant l'ús de promotor GAP (PGAP) es va comparar amb la utilització del promotor induïble AOX1 (PAOX1) duent a terme cultius en quimiòstat per a la producció de Crl1. Tot i que en el cas del PAOX1 es va apreciar una major producció, s'hauria de considerar una avaluació econòmica prèvia a l'escalat del bioprocés, tenint en compte els nombrosos inconvenients de l'ús de metanol com a substrat. Finalment, seguint l'enfocament de l'enginyeria de soques, es va caracteritzar l'ús de dos nous promotors independents de l'ús de metanol sobre l'expressió de la lipasa B de Candida antarctica (CalB) com una poderosa eina que permeti explotar el potencial de P. pastoris a la RPP. Tots dos promotors van mostrar molt millors resultats en comparació als obtinguts amb el PGAP tot i que els patrons de producció entre els promotors va ser significativament diferent per a cada cas. En resum, els resultats mostrats al llarg dels diferents capítols de la present tesi reforcen la utilitat de l'enginyeria de bioprocessos i de soques a través dels diferents estudis realitzats, els quals van permetre obtenir millores significatives en l'eficiència de la RPP. El coneixement dels factors clau involucrats en l'expressió recombinant obre una àmplia finestra de noves oportunitats que fan possible que P. pastoris s'estableixi com una plataforma robusta per a la RPP, mostrant-se altament competitiva enfront dels sistemes convencionals. |
|---|