Estudios sobre el mecanismo de plegamiento de proteinas ricas en disulfuros. Estudios sobre el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI)
El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres p...
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2001 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3458 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-1015101-130435 http://hdl.handle.net/10803/3458 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Proteinas Plegamiento Bioquímica Ciències Experimentals 1 |
| Sumario: | El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres puentes disulfuro formados por las cisteínas C8- C27, C12- C24 y C18- C34. La presencia de estos puentes disulfuro nos permite estudiar el replegamiento del PCI a través de la captura de los intermediarios que se forman en el proceso de plegamiento a partir de la proteína reducida. Esto permite conocer el número de intermediarios dependientes de disulfuro, su diversidad, su estructura y sus propiedades, proporcionándonos información sobre el mecanismo de plegamiento.<br/><br/>En una primera fase del presente trabajo, hemos estudiado el aislamiento y la purificación de los intermediarios con tres puentes disulfuro (denominados "scrambled species") a partir de la mezcla de intermediarios que se obtiene tras efectuar el replegamiento del PCI a partir de PCI purificado o a partir de cultivos de E. Coli que expresan PCI. Así mismo, hemos realizado una caracterización estructural de los intermediarios "scrambled" aislados en forma pura, se han determinado sus constantes de inhibición, éstas son del orden mM (unas 1000 veces superiores a la estimada para el PCI nativo). También se ha determinado cuáles son las cisteínas implicadas en cada uno de los puentes disulfuro de la estructura de tales especies mediante digestión proteolítica y mediante reducción química parcial de un puente disulfuro. Finalmente se ha realizado un análisis conformacional por estudios de Dicroísmo Circular y Resonancia Magnética Nuclear, técnicas que nos han permitido observar que tales intermediarios no presentan una estructura mayoritaria definida.<br/><br/>En una segunda fase, hemos estudiado la última etapa del camino de plegamiento del PCI, etapa donde las especies '"scrambled"" rompen y vuelven a formar sus puentes disulfuro para dar lugar a la estructura nativa. Con este fin se ha estudiado la estabilidad relativa de estos intermediarios frente a agentes desnaturalizantes y se han llevado a cabo experimentos cinéticos de su evolución a estructura nativa. Estos experimentos han probado que el plegamiento del PCI no tiene lugar a través de una vía única sino que se dan múltiples vías paralelas. Se han observado que los intermediarios que son más estables frente a agentes desnaturalizantes son los que presentan una evolución más lenta hacia la forma nativa.<br/><br/>Finalmente en una tercera fase, se ha estudiado la influencia de agentes redox en la producción de PCI recombinante y en otras proteínas relacionadas. Se observó que la expresión de éstos en E. Coli, en forma secretada al medio, se acumulaba gran parte de la proteína en forma de intermediarios tipo "scrambled". Se ha determinado que la forma más eficiente para convertir estas especies en proteína nativa, consiste en la adición al medio tras el cultivo de agentes redox para catalizar el proceso de "reshuffling". De esta forma se consiguen importantes mejoras en el rendimiento de la producción. |
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