Estudi estructural i cinètic de l'especificitat de coenzim d'una alcohol deshidrogenasa d'amfibi dependent de Nadp(h)
Els teixits gàstrics de l'amfibi Rana perezi expressen una alcohol deshidrogenasa (ADH8) dependent de NADP(H), una especificitat de coenzim única dintre de les ADHs de vertebrat. Aquest enzim és actiu amb etanol i retinoides. Han estat resoltes i refinades les estructures tridimensionals de l&#...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2004 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3519 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0117105-173718 http://hdl.handle.net/10803/3519 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Coenzim Retinoides Adh Ciències Experimentals 616.7 |
| Sumario: | Els teixits gàstrics de l'amfibi Rana perezi expressen una alcohol deshidrogenasa (ADH8) dependent de NADP(H), una especificitat de coenzim única dintre de les ADHs de vertebrat. Aquest enzim és actiu amb etanol i retinoides. Han estat resoltes i refinades les estructures tridimensionals de l'ADH8 i del complex binari ADH8-NADP+ a 2,2 i 1,8 Å, respectivament. ADH8 presenta una identitat de seqüència amb ADHs dependents de NAD(H) de vertebrat inferior al 60%. La seva especificitat de coenzim i de substrat suggereixen un paper d'aquest enzim en la reducció d'aldehids més que en l'oxidació d'alcohols. El gran volum del seti d'unió al substrat pot explicar les altes eficiències catalítiques d'ADH8 amb retinoides. La preferència per el NADP(H) sembla ser deguda a la presència en ADH8 de la triada Gly223-Thr224-His225, i al manteniment dels residus conservats Lys228 i Leu200, que defineixen un seti d'unió per el grup fosfat terminal del cofactor. El NADP(H) s'uneix a l'ADH8 amb una conformació extesa. Aquest coenzim es pot superposar amb el NAD(H) unit en complexos d'ADHs dependents de NAD(H). Les desviacions conformacionals més grans corresponen al grup adenina-ribosa de la molècula. No s'observaren diferències adicionals en el seti d'unió al dinucleòtid, fet que explicaria que el NAD(H) pugui també ser utilitzat com a cofactor per ADH8.<br/>En el complex crystal.logràfic ADH8-NADP+, el seti d'unió del grup fosfat extra del coenzim està format per Gly223-Thr224-His225, residus específics de l'ADH8, i per les posicions conservades Leu200 i Lys228. Amb l'objectiu d'investigar els mínims determinants estructurals responsables de l'especificitat de coenzim, diferents mutants d'ADH8 en les posicions 223-225 foren dissenyats i cinèticament caracteritzats. El mutant G223D, tot i presentar una càrrega negativa en el seti d'unió al fosfat, encara preferia el NADP(H) com a coenzim, de la mateixa manera que els mutants T224I i H225N. Les eficiències catalítiques amb NADP(H) disminuiren dramàticament en els dobles mutants, G223D/T224I i T224I/H225N, i en el triple mutant G223D/T224I/H225N (kcat/KmNADPH = 760 mM-1min-1), respecte l'enzim silvestre (kcat/KmNADPH = 133330 mM-1min-1). Aquest resultat fou associat amb una més baixa afinitat per el NADP+ i amb un canvi en l'etapa limitant de la reacció. Contràriament, en el triple mutant, l'eficiència catalítica amb NAD(H) incrementà, assolint valors (kcat/KmNADH = 155000 mM-1min-1) similars als de l'enzim silvestre amb NADP(H). La reversió completa de l'especificitat de coenzim de l'ADH8 doncs, fou aconseguida amb únicament la substitució de tres residus consecutius en el seti d'unió del fosfat extra, un resultat sense precedents dintre de la família ADH. |
|---|