Identificación de proteínas coiled-coil específicas de plantas en el núcleoesqueleto de Allium cepa l. Var. Francesa

Las proteínas de tipo coiled coil son los componentes mayoritarios del núcleoesqueleto (NSK) de metazoos cuya principal familia son las laminas. Las plantas carecen de ortólogos de los genes que codifican para estas proteínas aunque tienen proteínas que son reconocidas por anticuerpos contra ellas,...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Pérez-Munive, Clara
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2011
País:España
Institución:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Repositorio:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
OAI Identifier:oai:digital.csic.es:10261/120927
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10261/120927
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Núcleoesqueleto
Proteínas coiled-coil
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description Las proteínas de tipo coiled coil son los componentes mayoritarios del núcleoesqueleto (NSK) de metazoos cuya principal familia son las laminas. Las plantas carecen de ortólogos de los genes que codifican para estas proteínas aunque tienen proteínas que son reconocidas por anticuerpos contra ellas, demostrando la conservación de epítopos. Esto nos llevó a formular la hipótesis de que las plantas podrían tener proteínas estructurales del NSK específicas con dominios conservados con las proteínas animales pero con similitud de secuencia muy baja, que constituirían homólogos funcionales de las mismas. El objetivo de esta Tesis Doctoral era investigar las proteínas estructurales de tipo coiled coil en el NSK de células meristemáticas de la planta monocotiledónea Allium cepa, un sistema en el que se conocen abundantes datos sobre su NSK. Se han analizado dos tipos de proteínas con estructura coiled-coil: espectrinas y filamentos intermedios nucleares (NIFs). Las plantas carecen de ortólogos claros de las proteínas de la superfamilia de espectrina pero tienen secuencias que podrían ser homólogos funcionales, así como proteínas que son reconocidas por los anticuerpos antiespectrinas. En este trabajo hemos utilizado anticuerpos contra las cadenas α y β de espectrina eritrocítica de pollo y  espectrina no eritrocítica de mamíferos que han demostrado la presencia de proteínas inmunológicamente relacionadas con ellas en el núcleo de Allium cepa y han permitido su caracterización. El análisis inmunoquímico ha revelado dos bandas con movilidad electroforética semejante a las espectrinas α y β (240 y 220 kDa), aunque la más abundante es una banda de 60 kDa con varias formas isoeléctricas con valores entre 5,1 y 5,7 de pI, así como bandas intermedias que corresponden probablemente a productos de degradación proteolítica. Los resultados de inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro para ME demostraron una distribución de las proteínas en diferentes dominios nucleares: envoltura nuclear, retículo intercromatínico y pericromatínico, nucleolo y focos nucleares, sugiriendo su implicación en diversas funciones nucleares. La extracción secuencial de los núcleos ha demostrado que estas proteínas son componentes estructurales del NSK subyacente. Mediante inmunoprecipitación hemos revelado la asociación de las proteínas semejantes a espectrina nucleares con actina, demostrando que son proteínas de unión a actina (ABPs) nucleares estructurales en este sistema. Los datos de co-localización mediante inmunofluorescencia confirman que esta asociación ocurre también in situ en el retículo intranuclear y en focos nucleares. El análisis preliminar de secuencias de péptidos de la banda de 60 kDa mediante espectrometría de masas no ha revelado similitud alta con ninguna de las proteínas de la familia de la espectrina aunque mostró similaridad baja con la nesprina-1 humana, una proteína del NSK que contiene repeticiones de espectrina.
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El objetivo de esta Tesis Doctoral era investigar las proteínas estructurales de tipo coiled coil en el NSK de células meristemáticas de la planta monocotiledónea Allium cepa, un sistema en el que se conocen abundantes datos sobre su NSK. Se han analizado dos tipos de proteínas con estructura coiled-coil: espectrinas y filamentos intermedios nucleares (NIFs). Las plantas carecen de ortólogos claros de las proteínas de la superfamilia de espectrina pero tienen secuencias que podrían ser homólogos funcionales, así como proteínas que son reconocidas por los anticuerpos antiespectrinas. En este trabajo hemos utilizado anticuerpos contra las cadenas α y β de espectrina eritrocítica de pollo y  espectrina no eritrocítica de mamíferos que han demostrado la presencia de proteínas inmunológicamente relacionadas con ellas en el núcleo de Allium cepa y han permitido su caracterización. El análisis inmunoquímico ha revelado dos bandas con movilidad electroforética semejante a las espectrinas α y β (240 y 220 kDa), aunque la más abundante es una banda de 60 kDa con varias formas isoeléctricas con valores entre 5,1 y 5,7 de pI, así como bandas intermedias que corresponden probablemente a productos de degradación proteolítica. Los resultados de inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro para ME demostraron una distribución de las proteínas en diferentes dominios nucleares: envoltura nuclear, retículo intercromatínico y pericromatínico, nucleolo y focos nucleares, sugiriendo su implicación en diversas funciones nucleares. La extracción secuencial de los núcleos ha demostrado que estas proteínas son componentes estructurales del NSK subyacente. Mediante inmunoprecipitación hemos revelado la asociación de las proteínas semejantes a espectrina nucleares con actina, demostrando que son proteínas de unión a actina (ABPs) nucleares estructurales en este sistema. Los datos de co-localización mediante inmunofluorescencia confirman que esta asociación ocurre también in situ en el retículo intranuclear y en focos nucleares. El análisis preliminar de secuencias de péptidos de la banda de 60 kDa mediante espectrometría de masas no ha revelado similitud alta con ninguna de las proteínas de la familia de la espectrina aunque mostró similaridad baja con la nesprina-1 humana, una proteína del NSK que contiene repeticiones de espectrina.Aunque las plantas carecen de genes para las proteínas de tipo filamentos intermedios incluídas las laminas, poseen proteínas inmunológicamente relacionadas con ellos. Los NIFs son proteínas nucleares específicas de plantas descritas en Pisum sativum que presentan reacción cruzada con el anticuerpo general contra filamentos intermedios IFA y varios anti-laminas, y se ha propuesto que podrían realizar el papel funcional de las laminas en plantas. El objetivo de nuestro estudio era investigar la conservación y características de las NIFs en la monocotiledónea Allium cepa y compararlas con las proteínas semejantes a laminas descritas previamente en esta especie. Para ello hemos utilizado varios anticuerpos contra una de las NIFs de Pisum sativum (p65). Todos ellos reconocen un doblete de 65-60 kDa en el núcleo de Allium cepa. Mediante inmunodetección en membranas bidimensionales se resolvieron claramente dos manchas de 65 kDa con pI 5,4 y 5,6 y otras dos de 60 kDa con pIs menos acídicos de 6,5 y 6,6. Los resultados de inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro para ME han demostrado la localización de las proteínas en la envoltura nuclear y una delicada red intranuclear coincidente con los dominios pericromatínicos. La extracción secuencial de los núcleos demostró que las proteínas forman parte del NSK. Los datos de movilidad electroforética, pI, distribución nuclear y asociación al NSK son similares a los de algunas de las proteínas previamente descritas como laminas en Allium cepa y sugieren que podría tratarse de las mismas proteínas. Hemos demostrado mediante co-inmunoprecipitación y co-localización que los dos tipos de proteínas estructurales analizadas, las proteínas semejantes a espectrina y NIFs, interaccionan y co-localizan en una red intranuclear y en focos nucleares, demostrando que ambos componentes están asociados en el complejo multiproteico del endoesqueleto.Peer reviewedMoreno Díaz de la Espina, SusanaConsejo Superior de Investigaciones Científicas [https://ror.org/02gfc7t72]2011info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06Publisher's versioninfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://hdl.handle.net/10261/120927reponame:DIGITAL.CSIC. 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