Functional and structural studies of AKR1B15 and AKR1B16: Two novel additions to human and mouse aldo-keto reductase superfamily
La superfamília de les aldo-ceto reductases (AKR) comprèn un gran nombre de proteïnes monomèriques de localització citosòlica d’un un pes molecular d'aproximadament 36 kDa. Les AKRs tenen un plegament proteic comú evolutivament conservat, que consisteix en un barril (α/β)8. La majoria d’AKRs ac...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2016 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/393987 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/393987 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Inhibidor aldosa reductasa Aldose reductase inhibidor Cinètica enzimàtica Enzyme kinetics Cinética enzimática Àcid retinoic Retinoic acid Ácido retinoico Ciències Experimentals 577 |
| Sumario: | La superfamília de les aldo-ceto reductases (AKR) comprèn un gran nombre de proteïnes monomèriques de localització citosòlica d’un un pes molecular d'aproximadament 36 kDa. Les AKRs tenen un plegament proteic comú evolutivament conservat, que consisteix en un barril (α/β)8. La majoria d’AKRs actuen reduint aldehids i cetones als seus respectius alcohols en una reacció dependent de NADPH, amb un ampli espectre de substrats que va des de sucres simples fins a aldehids potencialment tòxics. Aquesta Tesi s’emmarca dins l’estudi estructural i funcional de les AKR realitzat pel nostre grup, especialment la seva contribució dins la via de biosíntesi de l’àcid retinoic (RA). El nostre grup va descriure activitat retinaldehid reductasa en la família AKR i des de llavors ha estat involucrat en l’estudi funcional i estructural de les AKR humanes en relació amb aquest important paper fisiològic. El grup va obtenir l’estructura cristal·logràfica d’AKR1B10, un enzim sobre-expressat en càncer. Es va proposar una relació entre l’alta activitat retinaldehid reductasa de l’enzim i el desenvolupament del càncer. La primera part d’aquesta Tesi està basada en la purificació i caracterització d’un nou enzim AKR humà; AKR1B15, amb un 92% d’identitat seqüencial amb AKR1B10. La proteïna recombinant precipitava en cossos d’inclusió al purificar-se, mostrant activitat limitada quan era solubilitzada amb detergents. Gran part del material solubilitzat estava en forma d’agregats d’alt pes molecular sense activitat. Vam desenvolupar una aproximació nova en AKRs, utilitzant un sistema de coexpressió amb xaperones, incrementant així la forma soluble i monomèrica de la proteïna. L’activitat enzimàtica va ser caracteritzada amb un ampli rang de substrats típics d’AKR. AKR1B15 mostra valors de Kcat i de Km més baixos que AKR1B10, excepte per cetones i α-dicarbonils. Encara més, mostra una eficiència catalítica superior envers el 9-cis-retinaldehid que no pas AKR1B10, trobant-se entre les 9-cis-retinaldehid reductases més eficients de les AKR. Estudis d’inhibició han mostrat que l’enzim té una selectivitat pels inhibidors més restrictiva que no AKR1B10 o AKR1B1, i diversos inhibidors coneguts d’aldosa reductasa (ARI) no l’inhibeixen. Es va construir un model estructural per analitzar les diferències en el lloc d’unió a substrat d’AKR1B15. Els canvis de residus localitzats en els llaços A i C donen lloc a centre actiu més petit, hidrofòbic i rígid d’AKR1B15 comparat amb AKR1B10, cosa que explica la diferent especificitat de substrat i diferent selectivitat d’inhibidors. Es va fer un estudi cel·lular de l’activitat retinaldehid reductasa per transfecció transitòria d’AKR1B15 i AKR1B10 utilitzant cèl·lules HEK293T com a model. Es va observar que AKR1B10, però no AKR1B15, participava en la reducció del retinaldehid i provocava canvis en els nivells cel·lulars d’àcid retinoic. La segona part d’aquesta Tesi s’ha centrat en les diferències estructurals de les butxaques d’unió d’AKR1B15 i AKR1B10 i la diferent funció dels dos enzims. Mutants d’AKR1B10 van ser preparats intentant mimetitzar la butxaca catalítica d’AKR1B15, amb l’objectiu de convertir aquest enzim en l’altre, i comprendre quins són els factors que determinen la diferent selectivitat dels dos enzims. Els mutants van mostrar valors de kcat i de Km més elevats que els enzims salvatges, amb característiques que els assemblaven a AKR1B15, com l’activitat front cetones i la seva habilitat per reduir eficientment el 9-cis-retinal. Finalment, es va realitzar la caracterització d’un nou enzim de ratolí, AKR1B16. Estudis previs havien determinat que AKR1B16 era una proteïna activa expressada en teixits. En aquesta Tesis s’ha realitzar una anàlisi filogenètica, una caracterització cinètica i s’ha determinat la seva activitat amb retinoides. L’enzim va mostrat activitat moderada amb tots els substrats analitzats, amb activitat baixa front retinaldehid. Els resultats porten a la conclusió que AKR1B16 no és una proteïna ortòloga d’AKR1B10 o cap altra AKR1B humana. |
|---|