Structural and kinetic features of three human aldehyde dehydrogenases, ALDH1A1, ALDH1A2 and ALDH1A3, active in retinoic acid biosynthesis
La superfamília de les aldehid deshidrogenases (ALDH) comprèn un elevat nombre de proteïnes dimèriques i tetramèriques, amb un pes molecular aproximat de 55 kDa per subunitat i amb diferents localitzacions cel·lulars (citoplasmàtica, mitocondrial i reticle endoplasmàtic). Les ALDH inclouen un grup e...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:207862 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/207862 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Aldehids Cinètica enzimàtica Àcid retinoic |
| Sumario: | La superfamília de les aldehid deshidrogenases (ALDH) comprèn un elevat nombre de proteïnes dimèriques i tetramèriques, amb un pes molecular aproximat de 55 kDa per subunitat i amb diferents localitzacions cel·lulars (citoplasmàtica, mitocondrial i reticle endoplasmàtic). Les ALDH inclouen un grup evolutivament relacionat d'enzims dependents de NAD(P)+, que catalitzen l'oxidació d'un ampli espectre de substrats aldehídics, generats a partir de diversos precursors endògens i exògens, als seus corresponents àcids carboxílics. Aquesta Tesi Doctoral forma part dels estudis estructurals i funcionals realitzats pel nostre grup de recerca sobre el paper de les oxidoreductases en el metabolisme dels retinoides. En aquests estudis s'han determinat les seves constants catalítiques amb aquests substrats, després de la solubilització amb albúmina sèrica bovina i mitjançant l'anàlisi d'activitat utilitzant una metodologia basada en HPLC. La Tesi pretén realitzar una anàlisi estructural i cinètica, exhaustiva i robusta, sobre els enzims humans implicats en l'oxidació irreversible del retinaldehid a àcid retinoic. La primera part tracta sobre la comparació de la butxaca d'unió al substrat dels enzims humans ALDH1A, els quals van mostrar topologies similars i volums decreixents en les seves butxaques d'unió al substrat. Els tres enzims van ser subclonats, expressats i purificats en la seva forma soluble i activa. Pel que fa als valors de kcat/Km amb alcanals i alquenals, ALDH1A3 és l'enzim que presenta els valors més baixos per a tots els substrats, suggerint un paper moderat en l'oxidació fisiològica d'aquests aldehids. Els valors de kcat/Km d'ALDH1A1 i ALDH1A2 indiquen un paper potencialment important en la transformació d'aquests aldehids, encara que amb una especificitat de substrat lleugerament diferent. Per mesurar l'activitat de les ALDH1A amb un substrat fisiològic, el retinal, es va realitzar una optimització de la metodologia d'extracció en solvents orgànics. A partir dels mètodes avaluats, la barreja hexà/dioxà/isopropanol va permetre recuperar aproximadament el 100% de retinal i d'àcid retinoic. Els tres enzims van ser actius amb els dos isòmers del retinaldehid i van seguir una cinètica de Michaelis-Menten, amb valors de Km en el rang micromolar. En relació als valors de kcat, aquests van ser més elevats per al tot-trans-retinal (ALDH1A2 i ALDH1A3) o similar per a ambdós isòmers (ALDH1A1). ALDH1A3 va ser el millor enzim en termes d'eficiència catalítica, seguit per ALDH1A2. A més, s'ha descrit per primera vegada l'activitat enzimàtica dels enzims ALDH1A amb apo-β-carotenals, derivats de la digestió excèntrica del β-carotè. La segona part d'aquest treball es centra en el paper d'alguns residus específics en les propietats cinètiques dels enzims ALDH1A. Es va realitzar una mutagènesi dirigida, a partir de diferències estructurals en residus seleccionats de la butxaca d'unió al substrat. La substitució L114P en ALDH1A1 ha estat seleccionada per fer aquesta part de l'estructura més similar a ALDH1A2. Per altra banda, en ALDH1A2, es van realitzar quatre canvis de residus contigus, N475G, A476V, L477V i N478S, per imitar l'estructura d'ALDH1A1. Al mutant ALDH1A1 L114P, els valors de Km per a l'hexanal i el citral es van incrementar entre 50 i 100 vegades, en relació als valors d'ALDH1A1 salvatge. Per contra, l'ALDH1A2 mutant va mostrar una disminució de 50 vegades en el valor de la Km per al citral. A més, la disminució de 5 vegades en el valor de la kcat, va provocar que l'eficiència catalítica de l'ALDH1A2 mutant per al citral s'aproximés a l'observada a l'ALDH1A1 salvatge. En relació a les cinètiques amb els isòmers del retinal, els mutants no van mostrar diferències significatives amb els respectius enzims no mutats, de manera que els residus alterats no són crítics en l'especificitat per al retinal. Finalment, es van realitzar estudis d'inhibició dels enzims ALDH1A per trobar inhibidors nous, potents i selectius. Per primera vegada, s'han descrit alguns compostos que tenen efecte inhibidor sobre les ALDH1A. Aquests resultats preliminars semblen molt prometedors per desenvolupar nous farmacòfors en l'àmbit del disseny de fàrmacs basat en l'estructura. |
|---|