L'Increment de la dosi gènica com a estratègia de millora de la producció de proteïnes recombinants al llevat Pichia pastoris
La producció de proteïnes recombinants ha esdevingut la opció predilecta per la producció de productes biofarmacèutics i enzims industrials. Com a factories cel·lulars, els llevats presenten nombroses avantatges enfront d'altres microorganismes, com la seva capacitat per realitzar modificacions...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2016 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | catalán |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:174969 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/174969 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Pichia Pastoris Proteïnes recombinants Metanol |
| Sumario: | La producció de proteïnes recombinants ha esdevingut la opció predilecta per la producció de productes biofarmacèutics i enzims industrials. Com a factories cel·lulars, els llevats presenten nombroses avantatges enfront d'altres microorganismes, com la seva capacitat per realitzar modificacions post-traduccionals a les proteïnes, l'ampli ventall d'eines genètiques i la facilitat per créixer a altes densitats, entre d'altres. En aquest context, la idoneïtat del llevat metilotròfic Pichia pastoris en la producció de proteïnes recombinants ha destacat per sobre del llevat clàssic Saccharomyces cerevisiae, presentant una rellevància creixent en la producció de productes comercials recombinants. Entre d'altres factors, la presència del promotor AOX1 (PAOX1), d'expressió elevada i fortament regulat pel metanol, ha contribuït a la popularitat d'aquest sistema d'expressió. Per tal de millorar la producció de proteïna recombinant, s'han provat diverses estratègies, sent l'increment de la dosi gènica una de les més populars. Tot i que es pot obtenir una millora de la productivitat heteròloga amb aquesta metodologia, elevades dosis gèniques normalment comporten una sobrecàrrega metabòlica que deriva en productivitats baixes. Durant el transcurs d'aquesta tesi, s'ha utilitzat la lipasa de Rhizopus oryzae (Rol) com a proteïna model, expressada sota el control de PAOX1. Primer, es va construir una col·lecció de soques de P. pastoris amb un nombre creixent de còpies de ROL, i es va descriure per primer cop l'ús de la ddPCR (de l'anglès Droplet Digital PCR) per la determinació acurada de la dosi gènica a P. pastoris, demostrant una precisió més elevada que amb l'ús de la qPCR (de l'anglès quantitative real-time PCR) convencional. Segon, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays d'un grup de soques multicòpia, per tal d'entendre millor l'impacte de la dosi gènica de ROL a les rutes metabòliques. Concretament, les dades van revelar una forta regulació negativa de les rutes relacionades amb el metanol (entre d'altres), en consonància amb les dades fisiològiques obtingudes, que mostraven que les taxes de consum de la font de carboni i el creixement cel·lular eren dependents del nombre de còpies. A partir d'aquestes observacions, es va modificar una soca amb 4 còpies de ROL per tal que expressés una variant desregulada del factor de transcripció Mxr1, principal regulador de la ruta del metanol. Les dades fisiològiques i els nivells transcripcionals dels principals gens implicats en el metabolisme del metanol van confirmar la millora en la producció de Rol i l'increment en l'expressió dels gens relacionats amb el metanol i ROL. Finalment, es va dur a terme un estudi comparatiu a nivell transcriptòmic de la resposta de P. pastoris a l'expressió de tres proteïnes recombinants diferents, per tal d'estudiar l'impacte de la complexitat proteica i l'ús de sistemes d'expressió constitutius o induïbles. En resum, el present estudi descriu per primera vegada una aproximació a nivell de sistema de l'impacte d'una dosi gènica creixent en el llevat P. pastoris, permetent així el disseny de noves estratègies d'enginyeria cel·lular per tal de generar soques més productores, mitjançant la biologia sintètica i l'enginyeria metabòlica. |
|---|