Identification and partial characterization of acid phosphatases from Haemophilus parasuis
Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incl...
| Author: | |
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| Format: | doctoral thesis |
| Publication Date: | 2014 |
| Country: | España |
| Institution: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repository: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Language: | English |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:116412 |
| Online Access: | https://ddd.uab.cat/record/116412 |
| Access Level: | Open access |
| Keyword: | Fosfatases Haemophilus parasuis Proteïnes |
| Summary: | Haemophilus parasuis es una bacteria Gram negativa común en el tracto respiratorio superior de cerdos sanos y es el agente etiológico de la enfermedad de Glässer, que se caracteriza por poliserositis fibrinosa y poliartritis. En los últimos años, la prevalencia de las infecciones respiratorias, incluyendo la producida por H. parasuis, ha aumentado debido a prácticas de manejo de los animales, como el destete precoz, y a la aparición de virus inmunosupresores. Poco se sabe acerca de la patogénesis y los factores de virulencia de H. parasuis y esto complica el control de la enfermedad. Las fosfatasas ácidas son ubicuas en organismos eucariotas y procariotas y han recibido mucha atención con la finalidad de entender sus estructuras, funciones y mecanismos catalíticos. En bacterias Gram negativas estos enzimas tienen un papel esencial en numerosos procesos, incluyendo la patogénesis bacteriana. Resultados previos de nuestro grupo demostraron la presencia de fosfatasa ácida secretada en sobrenadantes de ciertas cepas de H. parasuis. De especial interés fue la observación de que la secreción de la fosfatasa se perdía tras pases de la bacteria en el laboratorio, indicando un papel de este enzima en la infección. Por lo tanto el objetivo principal de esta tesis fue identificar y caracterizar los genes responsables de esta actividad fosfatasa. El análisis de una genoteca de la cepa virulenta H. parasuis ER-6P permitió la identificación de 2 clones con actividad fosfatasa. Estos clones contenían los genes aphA y pgpB, respectivamente. El clonaje y análisis posterior de estos genes confirmó que codificaban dos fosfatasas. Específicamente, AphA muestra características típicas de fosfatasas ácidas bacterianas de clase B, incluyendo el dominio catalítico típico (motivo F-D-I-D-D-TV-L-F-S-S-P, localizado en el N-terminal y el motivo Y-G-D-[AS]-D-X-D-[IV] localizado cerca del C-terminal), un peso molecular teo rico de 24,33 KDa e inhibicio n por EDTA. Las fosfatasas ácidas bacterianas de clase B son un grupo de enzimas que forman homotetra meros y esta n presentes en una minorí a de bacterias, que incluye pato genos importantes. Por otro lado, PgpB es una fosfatasa de fosfatidilglicerofosfato, con seis dominios transmembrana, que pueden explicar su localización celular en la bacteria. Ambas proteínas, AphA y PgpB, mostraron un pH óptimo distinto que la actividad fosfatasa secretada por H. parasuis al sobrenadante. En un intento de purificar la fosfatasa secretada, sobrenadantes de H. parasuis fueron fraccionado por cromatografía de flujo por tamaño y las fracciones con actividad fosfatasa fueron analizadas por SDS-PAGE y MALDI-TOF-TOF. La proteína hipotética HPS_05483 se identificó en las fracciones con actividad fosfatasa, pero su expresión nativa recombinante no fue posible. Sin embargo, sí pudo ser purificada con una cola de His y se detectaron anticuerpos frente a ella en cerdos infectados, indicando que ésta proteína se expresa durante la infección. Se produjeron anticuerpos monoclonales (Acm) frente a un sobrenadante de H. parasuis con actividad fosfatasa y una selección inicial detectó Acm frente a Apha. Sin embargo, se debe realizar una selección más exhaustiva de los hibridomas para identificar Acm específicos frente a la fosfatasa del sobrenadante de H. parasuis. Finalmente, se estudió el efecto de sobrenadantes con actividad fosfatasa sobre los macrófagos. La expresión de marcadores de superficie de macrófagos alveolares CD163, SLAI, SLAII, sialoadhesina y SWC3 no se vio afectada por incubación con sobrenadantes de H. parasuis o sobrenadante de un clon que secretaba AphA. En conclusión, hemos identificado y caracterizado parcialmente dos fosfatasas de H. parasuis, AphA y PgpB. Sin embargo, más estudios son necesarios para determinar si la proteína hipotética HPS_05483 es realmente una fosfatasa. El papel de estos enzimas en la biología de H. parasuis debería ser estudiado en más profundidad. |
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