Estudi dels canvis estructurals de la permeasa de melibiosa d'Escherichia coli induïts per la unió dels substrats
La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'E. coli que permet l'acumulació d'α- i β-galactòsids gràcies a l'energia d'un gradient transmembrana de Na+, Li+ o H+. Es prediu una estructura secundària de 12 hèlixs transmembrana amb...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2006 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3548 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0809106-124826 http://hdl.handle.net/10803/3548 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | ATR-FTIR Permeasa de melibiosa Canvis estructuralS Ciències de la Salut 577 |
| Sumario: | La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'E. coli que permet l'acumulació d'α- i β-galactòsids gràcies a l'energia d'un gradient transmembrana de Na+, Li+ o H+. Es prediu una estructura secundària de 12 hèlixs transmembrana amb l'extrem N- i C-terminal en el cantó citoplasmàtic.<br/>L'objectiu d'aquest treball és l'obtenció d'informació estructural mitjançant espectres de diferència d'ATR-FTIR (infraroig per transformada de Fourier, reflexió total atenuada) on es resten dos espectres d'absorció en presència de diferents substrats de la MelB (Na+, Li+, H+ i melibiosa). La tècnica espectroscòpica de FTIR ens permet obtenir informació de l'estructura secundària i terciària de la MelB. A més, una característica important de la tècnica d'ATR-FTIR és que ens permet modificar el medi en que es troba la proteïna sense la necessitat de canviar de mostra.<br/>Els espectres de diferència indiquen canvis en estructures secundàries com: hèlix α (probablement canvis en la inclinació de les hèlixs transmembrana), làmines β, hèlixs 310, girs reversos i estructures desordenades. A més dels pics assignats a estructura secundària també s'observen una varietat de pics que poden correspondre a cadenes laterals com Asp, Glu, Asn, Trp i Tyr.<br/>La comparació dels espectres de diferència en D2O amb els obtinguts en H2O permet una millor assignació de l'estructura secundaria i, el que és molt interessant, la identificació de pics de residus com Asp i Glu. A partir d'aquests espectres es proposa que: 1) Les estructures involucrades en la unió de Na+ són més accessibles al solvent que aquelles que intervenen en la interacció amb la melibiosa en presència de Na+. 2) La unió de Na+ indueix uns canvis en la zona de vibració dels àcids carboxílics que deuen indicar una interacció d'aquests cations amb cadenes laterals d'Asp, que s'han proposat que formen part del lloc d'unió dels cations. En el següent pas, la interacció de melibiosa torna a induir uns canvis en la zona dels àcids carboxílics, on en aquest cas es poden assignar a un trencament de ponts salins entre les cadenes laterals d'Asp/Glu i Arg/Lys.<br/>Per tal d'aprofundir en l'estudi dels canvis conformacionals involucrats en les diferents etapes del transport es van realitzar els espectres de diferència del mutant R141C i de la MelB reaccionada amb el reactiu NEM (N-etilmaleimida). Aquestes dues permeases uneixen però no transporten els substrats, però fins a dia d'avui encara no està clar en quin pas bloquegen el transport dels substrats. El mutant R141C a més de la mutació de l'Arg consta de 4 mutacions més que corresponen a la substitució de les 4 Cys natives de la MelB per 3 Ser i una Val. Per tant, els espectres de diferència del mutant R141C es comparen amb els del mutant 3SV (permeasa sense Cys), que conserva aproximadament les mateixes propietats que la MelB salvatge a l'hora d'unir i transportar els substrats. Els espectres de diferència del mutant R141C són diferents que els espectres de diferència del mutant 3SV. En canvi, els espectres de diferència de la MelB reaccionada amb NEM són molt semblants als espectres de la MelB salvatge. Per tant, es dedueix que el mutant R141C té el seu transport bloquejat en un estat anterior del transport en comparació amb la MelB reaccionada amb NEM. En concret, és probable que el mutant R141C només uneixi els substrats, mentre que la MelB-NEM probablement queda bloquejada en l'estat que s'anomena "tancat" proposat pel transport simport. |
|---|