Enhancing recombinant adeno-associated virus (rAAV) production through cell and gene engineering
La teràpia gènica representa una revolució dins les teràpies emergents, amb l'objectiu de corregir o contrarestar mutacions genètiques i les seves malalties associades a través de la introducció, modificació o supressió de gens específics en les cèl·lules d'un individu. Els virus adenoasso...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2024 |
| País: | España |
| Recursos: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/692000 |
| Acesso em linha: | http://hdl.handle.net/10803/692000 |
| Access Level: | acceso embargado |
| Palavra-chave: | Vector viral Viral vector Bioprocés Bioprocess Bioproceso Teràpia gènica Gene therapy Terapia génica Ciències de la Salut 62 |
| Resumo: | La teràpia gènica representa una revolució dins les teràpies emergents, amb l'objectiu de corregir o contrarestar mutacions genètiques i les seves malalties associades a través de la introducció, modificació o supressió de gens específics en les cèl·lules d'un individu. Els virus adenoassociats recombinants (rAAVs) han sorgit com a vectors altament efectius per a aquesta finalitat, amb diverses teràpies basades en rAAVs ja aprovades per tractar malalties rares, augmentant la seva demanda en qualitat clínica. No obstant això, la complexitat dels mètodes de producció de rAAVs i la falta de processos de fabricació robustos incrementen els costos de les teràpies gèniques, restringint l'accés dels pacients a aquests tractaments i dificultant la seva aplicació en malalties més comunes. Per abordar aquests desafiaments, s'investiguen les limitacions en la producció de rAAVs i es proposen modificacions cel·lulars i genètiques per avançar en el desenvolupament de teràpies basades en rAAVs, especialment en rAAV9 i rAAV1. Aquesta anàlisi es divideix en dues parts principals. La primera part es centra en el desenvolupament d'estratègies d'optimització de la producció de rAAVs mitjançant l'expressió genètica transitòria (TGE). Encara que actualment la triple transfecció (TT) en cèl·lules HEK293 és una de les plataformes dominants per a la producció de rAAVs, la seva implementació presenta limitacions significatives, per aquest motiu, s'exploren mètodes alternatius per a la seva millora. En treballs anteriors, el mètode d'expressió genètica extesa (EGE) es va desenvolupar com una eina prometedora per millorar la producció de rAAVs, ja que permet superar la producció obtinguda pel mètode de TT, recollint els rAAVs en el medi extracel·lular, eliminant la necessitat de lisi cel·lular. Al Capítol u, el mètode de producció de rAAVs per TT es compara amb el mètode d'EGE a nivell molecular utilitzant proteòmica quantitativa. La comparació de l'expressió proteica diferencial i els processos moleculars de les cèl·lules HEK293 entre les dues metodologies de producció proporciona un anàlisi detallat sobre cada estat cel·lular, permetent identificar possibles limitacions que afectin el mètode TT de producció de rAAVs i possibles dianes per a l'enginyeria racional de línies cel·lulars. Al Capítol dos, s'utilitzen les dianes identificades per a l'enginyeria metabòlica de cèl·lules hoste, per millorar l'obtenció d'AAVs a la fracció extracel·lular. A més, s'estudia la suplementació del medi per mitigar els efectes negatius de l'alta densitat cel·lular sobre l'eficiència de transfecció. Al Capítol tres, s'estudia l'expressió del gen adenoviral E1A durant la producció de rAAVs en cèl·lules HEK293 com una possible limitació per a la producció de vectors virals. Es caracteritza la dinàmica d'expressió dels nivells d'E1A durant la producció de rAAVs i es proposen estratègies per preservar la seva expressió, millorant així la producció. La segona part, que comprèn els capítols quatre i cinc, se centra en explorar estratègies per a la prova de concepte d'un sistema d'expressió genètica estable (SGE) de producció de rAAVs, avaluant l'ús de diferents línies cel·lulars com a sistemes productors. Per això, s'empren tècniques d'enginyeria genètica per a l'expressió induïble basada en el sistema Tet-On, juntament amb l'eina de Disseny d'Experiments (DoE) per desenvolupar i optimitzar els mètodes de producció de rAAVs. Al Capítol quatre, s'explora un primer pas cap al mètode SGE basat en l'expressió del gen rep de forma induïble utilitzant una línia cel·lular que conté el gen adenoviral E1, com la cèl·lula HEK293. El Capítol cinc es centra en l'avaluació de línies cel·lulars alternatives per la producció de rAAVs. De forma global, els resultats presentats en aquesta tesi contribueixen al desenvolupament d'estratègies de producció de rAAVs més eficients i amb menors costos, utilitzant tant plataformes d'expressió genètica transitòria com de línies cel·lulars estables. |
|---|