Caracterización del sistema attB/attP-(FI)C31 para la producción de adenovirus gutless
El Ad es el vector más utilizado en ensayos clínicos con humanos. Para evitar la respuesta inmune celular inducida por los Ad de 1ª y 2ª generación, se han generado los vectores de 3ª generación, también llamados gutless o helper dependientes. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2007 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/3570 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-1126107-095808 http://hdl.handle.net/10803/3570 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Terapia génica Adenovirus Vectores virales Ciències Experimentals 578 |
| Sumario: | El Ad es el vector más utilizado en ensayos clínicos con humanos. Para evitar la respuesta inmune celular inducida por los Ad de 1ª y 2ª generación, se han generado los vectores de 3ª generación, también llamados gutless o helper dependientes. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos fundamentales: un Ad gutless con un gen terapéutico o marcador de interés; un Ad helper que aporte las proteínas virales necesarias in trans y; una línea celular permisiva para la producción de Ad. Los Ad gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no generan respuesta inmune celular y tienen una capacidad de hasta 36 Kpb. Se ha demostrado que la expresión de los genes que incorporan puede durar toda la vida del organismo. Sin embargo, si bien presentan grandes ventajas, su uso en ensayos clínicos con humanos todavía no ha sido viable debido a dos grandes inconvenientes: la contaminación por Ad helper y su producción a gran escala. Para solventar el problema de la contaminación por Ad helper, en este trabajo se propone un nuevo sistema de generación de Ad gutless basado en la recombinasa ?C31-attB/attP. Los Ad helper generados llevan flanqueada su señal ? por las secuencias attB/attP. ?C31 es una recombinasa unidireccional con lo que una vez realizada su función, al escindir la señal de empaquetamiento, evita la reacción inversa. Esta característica supone una ventaja frente a otras recombinasas como Cre ó FLPe. Sorprendentemente, al incorporar la secuencia attB entre el extremo ITR del Ad y su señal de empaquetamiento, los Ad helper generados alargan su ciclo viral hasta las 56-60 horas, sin embargo, ello no afecta la replicación eficiente del genoma viral y la producción de proteínas virales. Asimismo, se ha demostrado que tanto el proceso de empaquetamiento como el de la maduración de la partícula viral están afectados. Se ha observado que la clonación de una segunda señal de empaquetamiento en el extremo 3' normaliza los niveles de producción de los Ad controles, confirmando así que el genoma no queda retenido en ninguna región nuclear. Ensayos de EMSA han mostrado que diferentes proteínas celulares se unen a la secuencia attB y probablemente la unión de una de ellas impida el correcto empaquetamiento del genoma adenoviral. Por todo ello, el empaquetamiento diferencial por tiempo de los Ad helper-attB/attP generados ha sido aprovechado para la producción de Ad gutless acotando su producción a las 36 horas (tiempo en el que un Ad control completa su ciclo viral). Sin embargo, en las producciones de Ad gutless, los niveles de contaminación por Ad helper fueron elevados y éstos aumentaban significativamente en los sucesivos pasos de amplificación. El análisis del extremo 5' del Ad helper confirmó que éste recombinaba con el Ad gutless por la señal de empaquetamiento perdiendo las secuencias de recombinación y así su capacidad de empaquetarse más lentamente. Sin embargo, la inversión de la señal de empaquetamiento supuso la demostración de que este efecto es fácilmente evitable lo que convierte al Ad helper Ad5/FC31.Cre.?R en una buena herramienta para la producción de Ad gutless. |
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