Manipulació genètica del pàncrees per a l'estudi de la diabetis
La diabetis és una de les malalties més comunes. Els dos tipus principals són, la tipus 1 i la tipus 2, i es caracteritzen pel desenvolupament d’hiperglucèmia. En la diabetis tipus 1, aquest increment en la glucèmia apareix com a conseqüència d’una disminució de la massa de cèl·lula β i una pèrdua d...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2014 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/284937 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/284937 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Teràpia gènica Diabetis Pancrees Ciències Experimentals 575 |
| Sumario: | La diabetis és una de les malalties més comunes. Els dos tipus principals són, la tipus 1 i la tipus 2, i es caracteritzen pel desenvolupament d’hiperglucèmia. En la diabetis tipus 1, aquest increment en la glucèmia apareix com a conseqüència d’una disminució de la massa de cèl·lula β i una pèrdua de funcionalitat dels illots. Per tant, restablir una massa de cèl·lula β capaç de mantenir una adequada homeòstasi de la glucosa és un dels principals reptes de la medicina regenerativa pel tractament de la Diabetis. Per avaluar l’eficàcia d’aquests nous tractaments seria de gran interès disposar d’eines que permetin manipular genèticament el pàncrees in vivo. En aquest estudi, s’han desenvolupat tres aproximacions clau per a l’anàlisi de la massa de les cèl·lules β i de les cèl·lules acinars del pàncrees: un ratolí transgènic RIP-I/β-Gal el qual expressa la β-Galactosidasa (β-Gal) de forma específica a les cèl·lules β del pàncrees, i vectors virals Adeno-associats (AAV) i Adenovirus helper dependents (HdAd) que expressen diferents gens marcadors. En primer lloc s’ha generat el ratolí transgènic RIP-I/β-Gal per poder avaluar possibles canvis en la massa de cèl·lula β al llarg del temps i/o en processos patològics com la diabetis. De tots els animals fundadors obtinguts, només una de les línies, la L5, la de menor nombre de còpies presentava una elevada expressió de la β-Gal als illots pancreàtics, sent aproximadament el 90% de cèl·lules β del illot doble positives Ins+/β-Gal+. També, s’han dissenyat i produït vectors virals HdAd i AAV que expressen el gens reporters GFP o seAP (secreted Alkaline Phosphatase) específicament a les cèl·lules β o exocrines segons els promotor utilitzat, promotor d’insulina (hIns) o Elastasa, respectivament. Els HdAd, a diferència dels AAV, presenten una major capacitat de clonatge però la seva producció és més complexa. Després de la transducció via intraductal del pàncrees dels vectors HdAd-CMV-GFP o HdAd-Elastasa-GFP es va observar una disminució significativa de l’expressió de GFP als pocs dies de la injecció, degut a una forta infiltració limfocitària causada principalment per l’expressió de GFP. En canvi, quan s’utilitzava un marcador no immunogènic com la seAP l’expressió era detectada a llarg termini. Aquests resultats demostren per primer cop que la transducció del pàncrees exocrí i endocrí mitjançant vectors HdAd és possible i que l’expressió del gen d’interès es manté durant un període de temps llarg. En paral·lel als estudis amb els HdAd, s’ha demostrat la transducció al pàncrees exocrí i endocrí quan s’injectaven els vectors de serotip 9 (AAV9) per via intraductal i intravenosa a ratolins. Animals injectats per via intraductal amb els vectors AAV9-Elastasa-seAP mostraven nivells de seAP circulants a llarg termini. Aquests vectors han estat útils per avaluar les diferències de transducció segons la via d’administració i la soca de ratolí utilitzada, observant-se una elevada transducció en els ratolins C57Bl6 independentment de la via d’administració. La regeneració de cèl·lules β in vivo ha esdevingut un mètode prometedor per al tractament de la diabetis tipus 1. Donada l’eficiència i seguretat de les estratègies de transferència gènica mitjançant els vectors virals AAV, es van utilitzar aquests vectors per a transferir gens clau per a reprogramar les cèl·lules acinars del pàncrees cap a un fenotip β en ratolins diabètics immunocompetents. En aquest estudi es van utilitzar tres factors de transcripció claus implicats en el desenvolupament de la cèl·lula β: Pdx1 (Pancreas and duodenal homeobox gene-1), Neurog3 (Neurogenin 3) i MafA (PNM). Es va observar un increment estadísticament significatiu de l’expressió ectòpica dels tres factors al pàncrees i un increment de l’expressió de la insulina, tot i que no hem aconseguit disminuir la hiperglucèmia dels ratolins C57Bl6 diabètics. Però quan es van coinjectar els AAV9-PNM amb un Ad5-nul no codificant es va aconseguir una reprogramació parcial de les cèl·lules exocrines en productores d’insulina observant-se una expressió significativa del gen Ins1 (Insulina 1) i una disminució de les glucèmies dels ratolins diabètics. Per tant, les aproximacions desenvolupades en aquesta tesi han demostrat que la manipulació genètica del pàncrees, tant de les cèl·lules endocrines com de les exocrines, poden ser molt útils per avaluar possibles teràpies per a la diabetis o en altres malalties pancreàtiques. |
|---|