Caracterització de mutacions causants de la malaltia de Gaucher. Aproximació a una teràpia gènica.
[cat] La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim a...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2006 |
| País: | España |
| Institución: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/41890 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/2445/41890 http://www.tdx.cat/TDX-0802106-091643 http://hdl.handle.net/10803/1871 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Genètica humana Mutació (Biologia) Malalties hereditàries Malaltia de Gaucher Teràpia genètica Human genetics Mutation (Biology) Genetic diseases Gaucher's disease Gene therapy |
| Sumario: | [cat] La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C. Fins al moment s'han descrit més de 200 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP. Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la Glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids. Algunes de les mutacions descrites en el gen GBA són al·lels complexos, que són portadors de diferents mutacions, produïts per processos de recombinació entre el gen i el seu pseudogèn. En aquest treball presentem el cas d'un individu que va ser dignosticat erròneament com a homozigot per a la mutació N370S, quan realment era portador d'un al·lel complex no descrit fins al moment. A més, hem volgut caracteritzar millor l'al·lel mutant RecNciI i per a això hem analitzat aquesta mutació en població espanyola i argentina, ja que és molt freqüent en aquesta última població, utilitzant diferents mètodes. D'aquesta manera també hem pogut trobar nous individus que tenien al·lels Rec i no s'havien pogut detectar, i entendre millor els mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests al·lels. També s'han analitzat mostres de pacients de la malaltia de Gaucher que eren candidats de ser portadors de mutacions en el gen PSAP. Aquest anàlisi ens ha permès decriure una mutació en la Saposina D que juntament amb una altra mutació ja descrita prèviament és la causant de la patologia. Fins al moment s'han desenvolupat diferents tècniques de teràpia gènica, però en general tenen moltes limitacions. Per una banda els vectors utilitzats poden generar reaccions immunes (adenovirus) o integracions a l'atzar en el genoma (retrovirus). Per altra banda, el gen forani deixa d'expressar-se després d'un cert temps. Per tot això és lògic que s'hagin desenvolupat noves estratègies per a la teràpia de malalties genètiques. Una d'aquestes aproximacions és l'utilització de quimeraplasts, molècules quimèriques de RNA-DNA capaces de promoure la correcció d'una mutació mitjançant els mecanismes de reparació de la cèl·lula. En la malaltia de Gaucher una de les mutacions més freqüents és la L444P. Hem intentat corregir aquesta mutació utilitzant quimeraplasts en fibroblasts d'un pacient de la malaltia de Gaucher homozigot per la mutació L444P. Els resultats obtinguts mostren una molt baixa, o nul·la, eficiència de correcció. Recentment s'han publicat diferents treballs on descriuen també resultats negatius per altres malalties utilitzant aquesta tècnica, deixant en entredit l'eficàcia d'aquesta tècnica. Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. La teràpia de reducció de substrat es basa en la inhibició parcial de la glucosilceramida sintasa (GCS), enzim encarregat de sintetitzar glucosilceramida a partir de ceramida i glucosa. D'aquesta manera s'evita l'acúmul de glucosilceramida que provoca la malaltia. En els darrers anys, els siRNAs (small interference RNAs) s'han utilitzat en diferents tipus d'experiments per inhibir l'expressió gènica. L'objectiu d'aquest treball és la inhibició de la expressió del gen de la GCS mitjançant siRNAs com una possible alternativa terapèutica per a la malaltia de Gaucher. Vam dissenyar quatre siRNAs per a inhibir el gen GCS humà i els vam transfectar en cèl·lules HeLa. Amb dos d'aquests siRNAs vam aconseguir reduir la expressió de GCS a nivell de RNA. També vam comprovar la reducció tant a nivell d'activitat enzimàtica com de formació de glucosilceramida. Després d'aconseguir silenciar el gen de la GCS utilitzant siRNAs, vam decidir probar-ho utilitzant shRNAs (short-hairpin RNAs). Els shRNAs són siRNAs generats per un plasmidi on se li ha insertat la seqüència que s'ha de transcriure per formar aquest shRNA. Vam generar dos shRNAs diferents aconseguint inhibir també l'expressió de GCS. |
|---|