Novel insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis (Berliner)

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram positiva, ubicua y esporulante capaz de sintetizar proteínas con actividad insecticida específicas contra una gran variedad de insectos durante la esporulación (Cry y Cyt) y el crecimiento vegetativo (Vip y Sip). Estas proteínas han convertido a Bt en...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Palma Dovis, Leopoldo
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2013
País:España
Institución:Universidad Pública de Navarra
Repositorio:Academica-e. Repositorio Institucional de la Universidad Pública de Navarra
OAI Identifier:oai:academica-e.unavarra.es:2454/56044
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/2454/56044
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Bacillus thuringiensis
Proteínas insecticidas
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Producción Agraria
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description Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram positiva, ubicua y esporulante capaz de sintetizar proteínas con actividad insecticida específicas contra una gran variedad de insectos durante la esporulación (Cry y Cyt) y el crecimiento vegetativo (Vip y Sip). Estas proteínas han convertido a Bt en una alternativa a los insecticidas químicos eficaz y respetuosa con el medioambiente. Esta tesis doctoral se ha enfocado a la búsqueda y aislamiento de genes aún no descritos que codifican para proteínas insecticidas a partir de una colección Bt exclusiva de la Universidad Pública de Navarra (Pamplona, España). Con este objetivo, 500 cepas Bt de la colección procedentes de las Islas Canarias y de la Península Ibérica fueron analizadas mediante una combinación de técnicas basadas en PCR-RFLP con cebadores degenerados apropiados para la detección tanto de genes vip1/vip2 como de genes vip3. De este modo, se detectaron dos variantes del gen vip3A (vip3Aa45 y vip3Ag4), además de una nueva subfamilia de genes designados vip3C por el Comité de Nomenclatura de Toxinas Bt. Las proteínas Vip3Aa45 y Vip3Ag4 fueron expresadas en E. coli y se demostró que tienen un elevado potencial insecticida contra especies plaga de lepidópteros tales como Lobesia botrana (valores de CL50 aproximadamente 1–2 μg/ml) y Spodoptera littoralis (CL50 aproximadamente 20 ng/cm²). Vip3Ca3 fue también expresada en E. coli y, aunque demostró no ser tan efectiva como otras proteínas Vip3, incrementa la batería de proteínas insecticidas disponibles para el diseño de estrategias de manejo de resistencias de plagas a Bt. Las cepas Bt Hu4Q2 y LEAPI01, previamente descritas como tóxicas para lepidópteros, fueron completamente secuenciadas de novo mediante la tecnología de secuenciación masiva de nueva generación (NGS) Illumina. Las secuencias preliminares obtenidas poseían secuencias codificantes de proteínas insecticidas tales como cry1Ia, cry9Ea y vip3Ca2 (cepa Hu4Q2), y cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry2Ab, cry9Ea, dos variantes del gen cry1Ia y un gen vip3Aa (cepa LEAPI01). Además, las cepas H1.6 y H26.2 también fueron secuenciadas debido a que en la búsqueda inicial demostraron contener secuencias codificantes de genes noveles vip1/vip2. Las secuencias preliminares obtenidas demostraron poseer varios genes completos que codifican en su mayoría para proteínas insecticidas noveles pertenecientes a diferentes familias: cinco proteínas Cry de tres dominios, nueve proteínas Cry sin tres dominios (tipo Mtx, Bin y otras Cry relacionadas), tres Cyt, diez proteínas vegetativas insecticidas Vip1/Vip2 y una Sip1A. Los genes vip1/vip2 y sip1A (cepa H26.2) fueron expresados en distintos huéspedes heterólogos como Bacillus megaterium y E. coli, respectivamente, aunque de momento no han demostrado poseer actividad tóxica contra las especies analizadas (tres especies de coleópteros y siete de lepidópteros). Finalmente, una proteína Cry novel (cepa H1.5), inicialmente denominada Cry89 y expresada en E. coli, resultó ser muy tóxica contra la especie de pulgón Myzus persicae, con una CL50 de tan solo 32,7 μg/ml, el valor más bajo obtenido hasta la fecha para una proteína Cry activa contra una especie de hemíptero plaga. Los resultados y datos producidos en este estudio son científicamente relevantes y pueden utilizarse en el diseño de nuevos formulados insecticidas y en la construcción de plantas transgénicas resistentes a insectos.
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Con este objetivo, 500 cepas Bt de la colección procedentes de las Islas Canarias y de la Península Ibérica fueron analizadas mediante una combinación de técnicas basadas en PCR-RFLP con cebadores degenerados apropiados para la detección tanto de genes vip1/vip2 como de genes vip3. De este modo, se detectaron dos variantes del gen vip3A (vip3Aa45 y vip3Ag4), además de una nueva subfamilia de genes designados vip3C por el Comité de Nomenclatura de Toxinas Bt. Las proteínas Vip3Aa45 y Vip3Ag4 fueron expresadas en E. coli y se demostró que tienen un elevado potencial insecticida contra especies plaga de lepidópteros tales como Lobesia botrana (valores de CL50 aproximadamente 1–2 μg/ml) y Spodoptera littoralis (CL50 aproximadamente 20 ng/cm²). Vip3Ca3 fue también expresada en E. coli y, aunque demostró no ser tan efectiva como otras proteínas Vip3, incrementa la batería de proteínas insecticidas disponibles para el diseño de estrategias de manejo de resistencias de plagas a Bt. Las cepas Bt Hu4Q2 y LEAPI01, previamente descritas como tóxicas para lepidópteros, fueron completamente secuenciadas de novo mediante la tecnología de secuenciación masiva de nueva generación (NGS) Illumina. Las secuencias preliminares obtenidas poseían secuencias codificantes de proteínas insecticidas tales como cry1Ia, cry9Ea y vip3Ca2 (cepa Hu4Q2), y cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry2Ab, cry9Ea, dos variantes del gen cry1Ia y un gen vip3Aa (cepa LEAPI01). Además, las cepas H1.6 y H26.2 también fueron secuenciadas debido a que en la búsqueda inicial demostraron contener secuencias codificantes de genes noveles vip1/vip2. Las secuencias preliminares obtenidas demostraron poseer varios genes completos que codifican en su mayoría para proteínas insecticidas noveles pertenecientes a diferentes familias: cinco proteínas Cry de tres dominios, nueve proteínas Cry sin tres dominios (tipo Mtx, Bin y otras Cry relacionadas), tres Cyt, diez proteínas vegetativas insecticidas Vip1/Vip2 y una Sip1A. Los genes vip1/vip2 y sip1A (cepa H26.2) fueron expresados en distintos huéspedes heterólogos como Bacillus megaterium y E. coli, respectivamente, aunque de momento no han demostrado poseer actividad tóxica contra las especies analizadas (tres especies de coleópteros y siete de lepidópteros). Finalmente, una proteína Cry novel (cepa H1.5), inicialmente denominada Cry89 y expresada en E. coli, resultó ser muy tóxica contra la especie de pulgón Myzus persicae, con una CL50 de tan solo 32,7 μg/ml, el valor más bajo obtenido hasta la fecha para una proteína Cry activa contra una especie de hemíptero plaga. Los resultados y datos producidos en este estudio son científicamente relevantes y pueden utilizarse en el diseño de nuevos formulados insecticidas y en la construcción de plantas transgénicas resistentes a insectos.Bacillus thuringiensis (Bt) is an ubiquitous, Gram-positive and sporulating bacterium that synthesizes insecticidal proteins with specific toxicity against a wide range of insects during sporulation (Cry and Cyt) and vegetative growth (Vip and Sip). These proteins have portrayed Bt as an environment-friendly alternative to chemical insecticides. This thesis aimed at screening and isolating novel insecticidal protein genes from the Bt strain collection of the Universidad Pública de Navarra (Pamplona, Spain). For this purpose, 500 strains from the Canary Islands and mainland Spain were screened using a combined PCR-RFLP strategy with degenerate primers suitable for the detection of vip1/vip2 and vip3 genes. [ppl-ai-file-upload.s3.amazonaws] Two vip3A gene variants (vip3Aa45 and vip3Ag4), plus a novel vip3 gene subfamily designated vip3C by the Bt Toxin Nomenclature Committee, were identified. Vip3Aa45 and Vip3Ag4 were expressed in Escherichia coli and showed high toxicity against several lepidopteran pest species, with mean lethal concentration (LC50) values as low as approximately 1–2 μg/ml for Lobesia botrana and approximately 20 ng/cm² for Spodoptera littoralis. Vip3Ca3 was also expressed in E. coli and, despite its lower toxicity with respect to other Vip3A proteins, it adds up to the list of toxins available for resistance management. Previously reported strains Hu4Q2 and LEAPI01, toxic for lepidopterans, were entirely de novo sequenced using Illumina next generation sequencing (NGS) technology. Their draft genome sequences provided insecticidal coding sequences with homology to cry1Ia, cry9Ea and vip3Ca2 (from strain Hu4Q2), and cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry2Ab, cry9Ea, two cry1Ia gene variants and vip3Aa (from strain LEAPI01). In addition, strains H1.6 and H26.2 were sequenced because they contained novel vip1/vip2 gene coding sequences, as identified in the original screening analysis. Their draft genome sequences provided several full-length and mostly novel insecticidal protein coding sequences from different families: five three-domain Cry proteins, nine non-three-domain Cry proteins (Mtx-like, Bin-like and other related Cry proteins), three Cyt proteins, as well as ten secretable vegetative insecticidal proteins Vip1/Vip2 and a Sip1A. The vip1/vip2 and sip1A coding sequences (strain H26.2) were expressed in different heterologous hosts including Bacillus megaterium and E. coli, respectively. However, they did not show any toxicity against the insect species tested here (three coleopterans and seven lepidopterans). Finally, a novel Cry protein (strain H1.5), initially termed Cry89 and expressed in E. coli, exhibited high toxic activity against the green-peach aphid, Myzus persicae, with an LC50 value as low as 32.7 μg/ml, the lowest LC50 value reported to date for a Cry protein active against a hemipteran pest. The results and data provided in this study are scientifically relevant and can be implemented in the design of novel insecticidal formulations and in the construction of insect-resistant transgenic plants.Para la realización de esta Tesis Doctoral Leopoldo Palma Dovis obtuvo un contrato de ayudante de la Universidad Pública de NavarraPrograma de Doctorado en Biotecnología (RD 99/2011)Bioteknologiako Doktoretza Programa (ED 99/2011)Caballero Murillo, PrimitivoMuñoz Labiano, DeliaProducción AgrariaNekazaritza Ekoizpena2013info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/2454/56044reponame:Academica-e. Repositorio Institucional de la Universidad Pública de Navarrainstname:Universidad Pública de NavarraInglésinfo:eu-repo/semantics/openAccessoai:academica-e.unavarra.es:2454/560442026-06-17T12:41:47Z
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