Clonación y caracterización de un nuevo tipo de proteína fosfatasa en levadura

Fragmentos de DNA que contiene características estructurales encontrados en Ser /Thr proteínas fosfatasas fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de DNA genómico de levadura. La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de oligonucleótidos degenerados corresp...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Casamayor Gracia, Antonio|||0000-0003-2788-7329
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2009
País:España
Institución:Universitat Autònoma de Barcelona
Repositorio:Dipòsit Digital de Documents de la UAB
Idioma:español
OAI Identifier:oai:ddd.uab.cat:55060
Acceso en línea:https://ddd.uab.cat/record/55060
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Palabra clave:Llevats
Fosfoproteïnes fosfatases
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description Fragmentos de DNA que contiene características estructurales encontrados en Ser /Thr proteínas fosfatasas fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa a partir de DNA genómico de levadura. La amplificación se llevó a cabo mediante el uso de oligonucleótidos degenerados correspondientes a secuencias conservadas en las proteínas fosfatasas de tipo 1, 2A y 2B. Un fragmento de amplificación de 215 pares de bases se utilizó para un rastrear una biblioteca de DNA genómico seleccionada por tamaño. Se identificó un clon positivo que se aisló y secuenció. La secuencia de nucleótidos revela un ORF de 2076 pares de bases que codifica una proteína de 692 aminoácidos, a la que hemos denominado Ppz1. La mitad carboxi-terminal de esta proteína está estructuralmente relacionada con la fosfatasa de tipo 1, mientras que la mitad amino-terminal de la mitad de la proteína no está relacionada con las secuencias encontradas en otras proteínas fosfatasas. Esta región es muy rica en residuos de Ser y presenta un elevado número de aminoácidos básicos. Este producto génico representa una nueva clase de proteína fosfatasa en base a su singular estructura. El gen PPZ1, que está situado en el cromosoma XIII, se transcribe como un mRNA de aproximadamente 2,7 kilobases, y se ha encontrado que su cantidad aumenta de 3 a 4 veces a lo largo del cultivo. Hemos generado anticuerpos contra Ppz1 e identificado el producto génico de PPZ1 por análisis de inmunoblot a partir de extractos celulares como una proteína de 75-kDa. La cantidad de la proteína inmunoreactiva aumentó en las células que llevaban varias copias del gen. La interrupción del gen a dado lugar a células viables, sin detectarse cambios fenotípicos, lo que indica que el gen PPZ1 no es esencial para el crecimiento. Los experimentos de Southern blot preliminares en condiciones de baja estringencia han puesto de manifiesto la existencia de una secuencia genómica relacionada con PPZ1, a la que denominamos PPZ2.
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