Expression of the Rhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris under the control of the FLD1 promoter
Durant el curs d'aquest treball s'han realitzat l'expressió de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) sota en control del promotor FLD1 en el llevat Pichia pastoris i s'ha desenvolupat una estratègia de cultiu en semi-discontinu lliure de metanol. <br/>En primer lloc es va real...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2006 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/5308 |
| Acceso en línea: | http://www.tdx.cat/TDX-0412107-155334 http://hdl.handle.net/10803/5308 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Lipases Pichia pastoris Proteïna recombinant Tecnologies 663/664 |
| Sumario: | Durant el curs d'aquest treball s'han realitzat l'expressió de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) sota en control del promotor FLD1 en el llevat Pichia pastoris i s'ha desenvolupat una estratègia de cultiu en semi-discontinu lliure de metanol. <br/>En primer lloc es va realitzar la construcció d'un vector d'expressió que conté el gen de la ROL i el promotor FLD1. Aquest vector va ser subseqüentment transformat a P. pastoris. Els cultius en discontinu en bioreactor van revelar l'efecte sinèrgic del metanol i la metilamina com a substrats inductors sobre el promotor FLD1. A més, l'ús de sorbitol com a font de carboni, combinat amb la metilamina, ha resultat ser una combinació atractiva per evitar l'ús de metanol en cultius a altes densitats cel·lulars.<br/>En segon lloc es va desenvolupar una estratègia de cultiu en semi-discontinu fent servir sorbitol i metilamina com a fonts de carboni i nitrogen respectivament. Es van dur a terme tres cultius a diferents velocitats específiques de creixement, 0.005 h-1, 0.01 h-1, i 0.02 h-1. El nivell més alt de proteïna recombinant es va obtenir al cultiu realitzat a 0.02 h-1. Malgrat això la velocitat específica de producció a tots tres cultius es va disminuir després d'arribar a un màxim a prop de les 30 hores de cultiu. <br/>Per tal d'analitzar els potencials colls d'ampolla al procés de plegament i secreció, i la possible activació de la resposta a estres per proteïnes mal plegades (UPR) durant l'expressió de ROL, es van analitzar els nivell de la xaperona BiP, indicativa d'estres. També es van analitzar els nivells intracel·lulars de ROL. Es va utilitzar la immunofluorescència, combinada amb la citometria de flux per analitzar els nivells d'aquestes proteïnes. El increment dels nivells intracel·lulars de BiP i ROL durant la fase d'inducció dels cultius va indicar una possible activació de la resposta d'estres.<br/>Es va proposar una estratègia d'enginyeria metabòlica per tal alleujar els possibles colls d'ampolla en la via de plegament i secreció. El gen HAC1 de Saccaromyces cerevisiae es va clonar i expressar constitutivament a les cèl·lules de P. pastoris co-expressant ROL. El gen HAC1 codifica per un factor de transcripció el qual és responsable de l'activació del gens relacionats amb el UPR. Els resultats dels cultius amb les soques que expressen constitutivament el gen HAC1 van mostrar un increment en els nivells d'expressió de ROL, demostrant l'efecte positiu sobre el plegament i la secreció d'aquesta modificació. <br/>Per altra banda, una segona modificació es va realitzar per a millorar l'eficiència de secreció. El gen GAS1, el qual codifica per a una glycoproteïna ancorada a la membrana plasmàtica la qual realitza els unions entre els ?-glucans de la paret cel·lular va ser disruptat. La deleció d'aquest gen va provocar un canvi a la conformació de la paret cel·lular, fent-la més permeable al pas de proteïnes, fet que va resultar en un increment en els nivells de ROL extracel·lular. <br/>També es va dur a terme l'estudi dels nivells de transcripció de determinats gens de d'interès rellevant de P. pastoris. Concretament es van quantificar els nivells de transcripció del gen de l'alcohol oxidasa (AOX1), la formaldehid deshidrogenase (FLD1), la protein disulfide isomerase (PDI), la proteina BiP (gen KAR2), el 26S rRNA, i el gen de la proteïna ROL. Els nivells de transcripció d'aquests gens es van quantificar fent servir el sandwich hybridization assay basat en la immobilització específica dels mRNAs sobre esferes magnètiques i la seva posterior detecció mitjançant fluorimetria. La velocitat específica de producció va resultar ser un factor clau en els nivells de transcripció dels gens analitzats; a més, els resultats van aportar noves evidencies que l'expressió de ROL activa la resposta a estres. <br/>Finalment, amb l'objectiu de determinar la localització intracel·lular a P. pastoris del producte recombinant, el gen de la ROL es va fusionar amb el de la green fluorescent protein d'Aequorea victoria. En cultius en discontinu els nivells d'expressió de la proteïna de fusió van ser deu vegades inferiors als del cultiu control expressant solament ROL. A més, es va observar que la fluorescència d'un producte associat al creixement de P. pastoris, probablement la riboflavina, es superposava al senyal de la GFP al medi extracel·lular. Per altra banda es va observar una acumulació intracel·lular de la proteïna de fusió localitzada a l'espai periplasmàtic i dins de compartiments cel·lulars amb aparença vacuolar. <br/>Aquest estudi ha permès el desenvolupament i la millora del sistema d'expressió de P. pastoris basant-se en l'ús del promotor FLD1 com a alternativa al clàssic AOX1. |
|---|