Estudio estructural de la β-fructofuranosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous y su empleo para la producción de oligosacáridos prebióticos y otros derivados fructosilados

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-02-2019

Detalles Bibliográficos
Autor: Gimeno Pérez, María
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2019
País:España
Institución:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/687350
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10486/687350
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Enzimas - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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spelling Estudio estructural de la β-fructofuranosidasa de Xanthophyllomyces dendrorhous y su empleo para la producción de oligosacáridos prebióticos y otros derivados fructosiladosGimeno Pérez, MaríaEnzimas - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 28-02-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 28-08-2021La β-fructofuranosidasa XdINV de la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es una proteína extracelular altamente glicosilada que cataliza la liberación de fructosas de sustratos como sacarosa y rafinosa, además de sintetizar neo-fructooligosacáridos, compuestos en los que enlaces β(2-6) conectan unidades de fructosa a la glucosa de una sacarosa, interesantes en la industria alimentaria por sus características prebióticas. En este trabajo se desarrolló un efectivo sistema de expresión heteróloga basado en Pichia pastoris, que fue escalado a nivel de fermentador y permitió obtener grandes cantidades de proteína con características bioquímicas y sintéticas muy similares a las del productor natural. A su vez, el sistema desarrollado constituyó una gran herramienta para la fácil manipulación de la secuencia génica responsable de XdINV, que se usó con el objetivo de ahondar en el análisis estructural de la proteína mediante mutagénesis dirigida. El estudio por RMN de los cristales proteicos obtenidos confirmó la estructura dimérica de XdINV, cuyos monómeros presentaban la arquitectura típica de la familia 32 de las glicosilhidrolasas. Sin embargo, la proteína mostró un inusual patrón de dimerización regido por la presencia de numerosos restos glucídicos unidos a residuos de asparaginas localizados en la interfase dimérica y una larga extensión del extremo C-terminal de la proteína, no observada en otras proteínas de la familia. La obtención de diferentes variantes mutagénicas de XdINV, así como la de diversos complejos cristalográficos con diferentes sustratos, permitió señalar la importancia del residuo Trp105 y el bucle flexible TIV en la actividad y especificidad enzimática de XdINV, así como identificar hasta 4 subsitios de reconocimiento de sustratos. Además, las características topológicas del centro activo de la proteína le permitieron albergar una gran cantidad de compuestos, siendo capaz de fructosilar diversos azúcares, polialcoholes y hasta algunos derivados fenólicos, de los cuales se purificaron e identificaron el trisacárido neoerlosa, obtenido por la modificación de maltosa, dos isómeros del hidroxitirosol fructosilado y la fructosil-hidroquinona. Por último, se plantearon diferentes estrategias de inmovilización de XdINV con el objetivo de aprovechar el gran potencial de esta enzima a nivel industrial. De entre ellas, el biocatalizador generado por atrapamiento en hidrogeles de polivinil alcohol mostró las mejores características en cuanto estabilidad operacional y formación de FOS.The β-fructofuranosidase XdINV from the Xanthophyllomyces dendrorhous yeast is a highly glycosylated extracellular protein that catalyzes the release of fructose from substrates such as sucrose and raffinose. In addition, XdINV synthesizes neo-fructooligosaccharides, compounds with β(2-6) linkage connecting fructose units to the glucosyl moiety of sucrose, which are interesting in the food industry for its prebiotic characteristics. In this work, an effective heterologous expression system based on Pichia pastoris was developed to obtain large amounts of the studied protein using fed-batch fermentation. The heterologous protein holds similar characteristics to the one synthetized by the natural producer. Besides, the developed system established an essential tool for an easier manipulation of the XdINV gene in order to deepen the protein structural analysis through directed mutagenesis. The NMR study of the protein crystals confirmed the dimeric structure of XdINV, whose monomers presented the typical architecture of the glycosylhydrolases family 32. However, the protein showed an unusual pattern of dimerization governed by the presence of glycans linked to asparagine residues at the dimer interface and a long extension of the protein C-terminus, not observed in other proteins of the family. The different mutagenic variants of XdINV and the crystallographic complexes with diverse substrates highlighted the importance of the Trp105 residue and the TIV flexible loop in the activity and specificity of this enzyme, and identified up to 4 subsites of substrate recognition. In addition, the topological characteristics of the XdINV active site allowed to accommodate a large number of compounds, being able to fructosylate multiple sugars, polyalcohols and even phenolic compounds, from which the trisaccharide neoerlose (obtained by maltose modification), two isomers of the fructosylated hydroxytyrosol and fructosyl-hydroquinone were identified. Finally, different immobilization strategies of XdINV were proposed to exploit the vast industrial potential of this enzyme. Among them, the biocatalyst generated by entrapment in polyvinyl alcohol hydrogels showed the best characteristics in terms of operational stability and FOS formation.Este trabajo de Tesis ha sido financiado por las ayudas a los proyectos “Búsqueda, mejora y sobreproducción de glicosidasas de levaduras que produzcan compuestos bioactivos de interés en alimentación” (BIO2013-48779-C4-4-R) y “Nuevas enzimas eucariotas para la producción de glicoderivados: producción, caracterización y mejora funcional” (BIO2016-76601-C3-2-R) otorgadas por el MINECO y MICINN.Fernández Lobato, MaríaDepartamento de Biología MolecularFacultad de CienciasCentro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)20192019-02-28doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/687350reponame:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAMinstname:Universidad Autónoma de MadridEspañolspaopen accesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2info:eu-repo/semantics/openAccessoai:repositorio.uam.es:10486/6873502026-06-23T12:46:27Z
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