Purification, formulation, and functionalization of HIV-1-based virus-like particles for vaccine and therapeutic applications
L'interès creixent en l'ús de partícules similivíriques (VLPs) com a candidats vacunals, vectors per a teràpia gènica i càncer, i nanotransportadors per a l'administració de fàrmacs ha incrementat la demanda de plataformes de biomanufactura eficients i escalables. La seva similitud es...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2024 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/692884 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/692884 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Partícules semblants a virus Virus-like particles Partículas similares a virus Purificació Downstream process Purificación Funcionalització Functionalization Funcionalización Ciències de la Salut 62 |
| Sumario: | L'interès creixent en l'ús de partícules similivíriques (VLPs) com a candidats vacunals, vectors per a teràpia gènica i càncer, i nanotransportadors per a l'administració de fàrmacs ha incrementat la demanda de plataformes de biomanufactura eficients i escalables. La seva similitud estructural amb els virus, sense els components virals infecciosos, els converteix en candidats excel·lents per a aquestes aplicacions. Tanmateix, la seva fabricació implica processos complexos, incloent la producció mitjançant cultiu cel·lular, purificació i formulació per complir amb els estàndards clínics. Aquesta tesi aborda els desafiaments crítics en el bioprocessament de VLPs en quatre capítols, centrant-se en la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH. La purificació de les VLPs és una fase crucial en el bioprocés per a l'eliminació de contaminants com ara vesícules extracel·lulars, proteïnes de les cèl·lules hoste i ADN. Al Capítol Ú, es comparen diverses tecnologies per optimitzar la purificació de les VLPs. El procés de purificació proposat inclou quatre passos clau: clarificació mitjançant filtració en profunditat i filtració estàndard, concentració i purificació intermèdia a través de filtració de flux tangencial o cromatografia multimodal, captura utilitzant cromatografia d'intercanvi iònic, cromatografia d'interacció hidrofòbica i afinitat per heparina, i poliment amb cromatografia d'exclusió per mida. L'estudi avalua cada pas en base al rendiment, la puresa i l'eficiència en l'eliminació de contaminants. Es defineix un procés de purificació integral basat en els millors resultats obtinguts en cada pas. Aquest procés aconsegueix un rendiment global del 38% i una puresa del 64%, complint amb els estàndards reguladors per a contaminants d’ADN i proteïnes. El Capítol Dos es centra en l'optimització de les formulacions de liofilització per a les VLPs de VIH mitjançant Disseny d'Experiments. S’avaluen diversos excipients, incloent crio-lio protectors, agents de càrrega, tampons, modificadors de tonicitat i surfactants, pel seu impacte en la mida, concentració i qualitat de les VLPs. La formulació optimitzada composta per sacarosa, arginina, TrisHCl, clorur de sodi i polisorbat 80 preserva amb èxit la integritat de les VLPs. Els estudis de termoestabilitat demostren que les característiques d'integritat estructural es mantenen a 4°C durant 4 setmanes, tant en forma liofilitzada com reconstituïda. Al Capítol Tres, els avenços en purificació i formulació s'apliquen per desenvolupar un procés biotecnològic complet, incloent una producció en perfusió seguida per un procés de purificació en tres passos. La producció en perfusió millora 2.4 vegades la productivitat volumètrica de les VLPs en comparació amb resultats anteriors. Els processos de purificació que segueixen, incloent l'aclariment secundari i la cromatografia d'intercanvi aniònic mostren valors aproximats de puresa del 60%. El pas final de liofilització manté la integritat de les VLPs. La funcionalització de les VLPs per a l'administració dirigida de fàrmacs representa una alternativa en la teràpia contra el càncer. Al Capítol Quatre s'explora l'ús de les VLPs de VIH funcionalitzades amb el pèptid T22, un conegut antagonista del receptor CXCR4 associat a diversos càncers. Les VLPs produïdes en cèl·lules HEK293 i purificades mitjançant el procés de purificació proposat al capítol ú es funcionalitzen mitjançant reaccions químiques. Els estudis in vitro demonstren que les VLPs funcionalitzades amb T22 es dirigeixen i penetren en cèl·lules positives per CXCR4 de forma específica, amb un augment notable en la fluorescència intracel·lular en comparació amb les VLPs no funcionalitzades. Aquesta especificitat ressalta el potencial de les VLPs com a nanotransportadors per a l'administració selectiva de fàrmacs. En general, aquesta tesi proporciona una exploració integral de la purificació, formulació i funcionalització de les VLPs de VIH-1, abordant desafiaments clau i obrint el camí per a la seva aplicació clínica com a vacunes i teràpies dirigides contra el càncer. |
|---|