Bioprocess Engineering for HIV-1 Gag VLP Production in HEK293 Cells
La importància de les noves tecnologies de producció de vacunes s’ha convertit recentment en un assumpte de gran rellevància a causa de l’aparició de la pandèmia COVID-19. No obstant això, el desenvolupament de les tecnologies de producció de vacunes com a mesura per a combatre les malalties infecci...
| Autor: | |
|---|---|
| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2021 |
| País: | España |
| Institución: | CBUC, CESCA |
| Repositorio: | TDR. Tesis Doctorales en Red |
| OAI Identifier: | oai:www.tdx.cat:10803/674392 |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/10803/674392 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Bioreactor Biorreactor Partícula semblant a virus (Vlp) Partícula semejante a virus (Vlp) Virus-like particle (Vlp) Enginyeria metabòlica Ingeniería metabólica Metabolic engineering Ciències Experimentals 576 |
| Sumario: | La importància de les noves tecnologies de producció de vacunes s’ha convertit recentment en un assumpte de gran rellevància a causa de l’aparició de la pandèmia COVID-19. No obstant això, el desenvolupament de les tecnologies de producció de vacunes com a mesura per a combatre les malalties infeccioses mai ha cessat. La recerca en el camp de les tecnologies de producció de vacunes està altament relacionada amb la recerca en enginyeria de bioprocessos. Aquesta tesi doctoral se centra en l’estudi del bioprocés per a produir partícules semblants a virus (VLPs) del virus de la immunodeficiència humana (VIH) basades en la poliproteïna Gag del mateix virus, usant cèl·lules HEK293 i transfecció transitòria com a plataforma productora. Aquestes VLPs són nanoestructures no infeccioses envoltades de membrana cel·lular la conformació de la qual s’assembla a la del virus natiu del VIH, però sense el seu material genètic. Posteriorment, la membrana que les envolta es pot modificar, afegint antígens d’altres malalties per a estimular el sistema immune i usar-les com a potencials vacunes. Per a poder optimitzar la producció de VLPs, és necessari l’estudi de múltiples factors, que van des de rutes metabòliques a nivell cel·lular fins al disseny de les condicions i paràmetres d’operació a escala de bioreactor. En el treball que es presenta en aquesta tesi doctoral, aquest repte pot dividir-se en tres parts principals. La primera part, presentada en els Capítols ú i dos, se centra en l’optimització del procés de producció de VLPs a nivell cel·lular, mitjançant proteòmica i enginyeria metabòlica. Aquí, els efectes de la transfecció transitòria i la producció de VLPs ha estat estudiada a nivell molecular usant proteòmica quantitativa per a identificar colls d’ampolla en el metabolisme influenciant la producció de VLPs. Una vegada identificats, s’han aplicat estratègies d’enginyeria metabòlica usant disseny d’experiments (DoE) per a optimitzar la transfecció i el procés de generació de partícules. La segona part, presentada en el Capítol tres, se centra en la intensificació i optimització de la producció de VLPs a nivell de bioreactor, establint un procés en perfusió. Per a això s’ha estudiat el medi de cultiu, els agents per a formar els complexos de DNA i les condicions de cultiu en el bioreactor. A més, usant estratègies com el DoE s’han optimitzat paràmetres operacionals com el recanvi específic de medi per cèl·lula (CSPR), la quantitat de DNA usada per a transfectar i els temps de retransfecció. Així mateix, s’han provat diferents equips de retenció cel·lular per a arribar a implementar un sistema de perfusió en continu. La tercera i última part, que comprèn els Capítols quatre, cinc i sis, se centra en la caracterització del producte, dirigida a dissenyar un procés de purificació eficient. Per a establir un mètode analític que determini l’estequiometria de la proteïna Gag en les VLPs produïdes en diferents tipus cel·lulars, s’ha usat la tècnica parallel reaction monitoring (PRM), contribuint a la millora de futurs mètodes de control de qualitat i analítics (PAT) per a un futur bioprocés a gran escala. A més, la vesícules extracelul·lars (EVs) que es coprodueixen amb les VLPs han estat estudiades mitjançant proteòmica quantitativa per a entendre la seva naturalesa ja que són les principals impureses de les preparacions de VLPs. D’igual forma s’ha caracteritzat el perfil de glicosilacions de les VLPs i les EVs per a ampliar el coneixement que i permetre dissenyar un procés de purificació específic per a VLPs. Els resultats que aquí es presenten contribueixen al desenvolupament d’una prometedora plataforma per a la producció de vacunes basades en VLPs de Gag i aplanen el camí per a l’avanç i l’evolució del camp de la producció de vacunes. |
|---|