Estudios de estructura y función de las interacciones de la trombina con sustratos fisiológicos
[spa]A pesar de las investigaciones y los importantes avances clínicos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En este sentido, el incompleto conocimiento estructural y funcional de los procesos que en última instancia conducen...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2013 |
| País: | España |
| Institución: | Universidad de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de la UB |
| OAI Identifier: | oai:diposit.ub.edu:2445/48363 |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/2445/48363 http://hdl.handle.net/10803/127100 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Trombosi Malalties cardiovasculars Lligands (Bioquímica) Coagulació Pèptids Hemostàsia Thrombosis Cardiovascular diseases Ligands (Biochemistry) Coagulation Peptides Hemostasis |
| Sumario: | [spa]A pesar de las investigaciones y los importantes avances clínicos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En este sentido, el incompleto conocimiento estructural y funcional de los procesos que en última instancia conducen a la formación del coágulo sanguíneo limita el desarrollo de nuevos antitrombóticos. La proteasa serínica trombina-α cumple un rol clave en el proceso de coagulación sanguínea debido a que activa diversas moléculas que son críticas para la formación del coágulo, entre estas se encuentran el fibrinógeno, el factor XIII, los receptores activados por proteasa en la superficie de las plaquetas (PAR1) y los factores V y VIII. Por estas razones, es imperativo comprender el dinamismo molecular de la trombina y sus interacciones con sustratos fisiológicos. En este sentido, en esta tesis se evaluó el efecto de diferentes ligandos sobre la estabilización de esta proteasa mediante calorimetría, fluorimetría y proteólisis limitada. Nuestros resultados demostraron que los ligandos FPR y el péptido C-terminal de la hirudina actúan sinérgicamente incrementando la termoestabilidad de la trombina. Además, determinamos que la resistencia a proteólisis en el exositio I de la proteasa se ve incrementada en presencia de benzamidina y FPR. Adicionalmente, en este trabajo de tesis doctoral, se analizaron dos de los sustratos más importantes de la trombina, el receptor PAR1 y el factor VIII. En este caso, nuestro objetivo principal fue caracterizar los mecanismos de las interacciones de estas proteínas con su proteasa activadora, la trombina. Para lograr este objetivo el ectodominio del receptor PAR1 y tres fragmentos de FVIII (FVIIIa1 a FVIIIa3; interconectores ácidos que preceden a los sitios de corte de activación) se clonaron, sobreexpresaron, purificaron para realizar ensayos de RMN y de cristalografía de rayos X. En este trabajo se cristalizó y resolvió la estructura 3D del complejo trombina•PAR1(R41S) (refinado a 3.0 Å), lo que nos permitió identificar que los residuos Lys51-Glu57 de PAR1 desempeñan una función esencial en las interacciones con el exositio I de la trombina. Finalmente, mediante ensayos de triple resonancia utilizando el fragmento recombinante FVIIIa1, marcado uniformemente con 13C y 15N, en presencia o ausencia de trombina permitió asignar las resonancias al esqueleto de carbonos α y β del interconector ácido a1. El análisis de las interacciones intermoleculares del FVIIIa1 con su proteasa activadora demostró que un subgrupo de residuos de este interconector son críticos para el reconocimiento del exositio I de la trombina. Estos resultados son un importante paso hacia la comprensión del mecanismo de activación del PAR1 y del FVIII catalizado por trombina. |
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