Oocyte competence: Study of melatonin and meiotic inhibitors to improve in vitro embryo production in juvenile goats

La producción in vitro de embriones (PIVE) tiene su mayor limitación en la eficacia de la maduración in vitro (MIV) de los oocitos. La MIV altera la competencia de los oocitos debido al efecto perjudicial de los radicales de oxígeno (ROS) y a la reanudación rápida y espontanea de la meiosis. En ooci...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Soto Heras, Sandra
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2019
País:España
Institución:CBUC, CESCA
Repositorio:TDR. Tesis Doctorales en Red
OAI Identifier:oai:www.tdx.cat:10803/667266
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10803/667266
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Competència oocitària
Competencia oocitaria
Oocyte competence
Producció in vitro d'embrions
Producción in vitro de embriones
In vitro embryo production
Maduració in vitro
Maduración in vitro
In vitro maturation
Ciències de la Salut
02
Descripción
Sumario:La producción in vitro de embriones (PIVE) tiene su mayor limitación en la eficacia de la maduración in vitro (MIV) de los oocitos. La MIV altera la competencia de los oocitos debido al efecto perjudicial de los radicales de oxígeno (ROS) y a la reanudación rápida y espontanea de la meiosis. En oocitos de cabras de 1 a 2 meses de edad, estos dos factores son más intensos y perjudiciales. En esta tesis, se plantearon dos estrategias para mejorar los protocolos de MIV en estos oocitos: A) Suplementar el medio de MIV con melatonina como potente antioxidante para disminuir los ROS; B) Diseñar un sistema bifásico de MIV con una fase de pre-maduración (pre-MIV) con inhibidores de la meiosis, seguida por una segunda fase de MIV convencional. El efecto de la melatonina fue evaluado en dos estudios. En el primero, se testaron diferentes concentraciones de melatonina (10-11, 10-9, 10-7, 10-3 M) en el medio de MIV. La suplementación con 10-7 M de melatonina aumentó el porcentaje de blastocistos (28.9% vs. 11.7% en el control) y redujo el nivel intra-oocitario de ROS. En el segundo estudio, evaluamos los mecanismos de acción de la melatonina (10-7 M) en los oocitos y detectamos la presencia del receptor de melatonina 1 (MT1) en oocitos y células del cúmulo mediante inmunocitoquímica. La melatonina incrementó la actividad mitocondrial y el ATP de los oocitos, redujo los ROS y mejoró la calidad de los blastocistos producidos in vitro (55.8 vs. 30.4 células de la masa celular interna), comparado con el grupo control sin antioxidantes. No pudimos determinar si estos efectos son mediados por el MT1 porqué el grupo melatonina más lucindol (antagónico del MT1) no mostró diferencias significativas respeto los grupos melatonina y control. La estrategia para mejorar la competencia de los oocitos mediante una pre-MIV con inhibidores meióticos se desarrolló en dos estudios. El primer estudio se llevó a cabo en la Universidad de Adelaida (Australia) en oocitos de bovino adulto. Evaluamos el efecto de distintas concentraciones del péptido natriurético tipo C (CNP; 50, 100, 200 nM) y el 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; 500 µM) sobre el arresto meiótico durante 6 y 24 h. El cultivo de pre-MIV con CNP (100 nM) más IBMX durante 6 horas obtuvo el mayor efecto de parada meiótica (92% de oocitos en vesícula germinal; VG). A continuación, diseñamos un sistema bifásico utilizando este protocolo de pre-MIV, seguido de 20 h de MIV convencional, y comparamos con una MIV control (24 h). La MIV bifásica prolongó la comunicación entre células del cúmulo y oocito, evaluada mediante la densidad de proyecciones de transzona (TZP), mejoró la actividad mitocondrial y aumentó la producción de blastocistos (45.1% vs. 34.5%). En el segundo estudio, analizamos un sistema similar en oocitos de cabras de 1 a 2 meses de edad. Primero, evaluamos el efecto de distintas dosis de CNP (50, 100, 200 nM) con o sin la adición de 10 nM de estradiol. La pre-MIV con CNP (200 nM) más estradiol mantuvo un 74.7% de oocitos en VG y una alta densidad de TZP durante 6 h. En segundo lugar, cultivamos los oocitos con MIV bifásica (6 h pre-MIV más 24 h MIV) comparado con MIV control (24 h). La MIV bifásica incrementó el glutatión intra-oocitario y disminuyó los ROS, aumentó la expresión de DNA metiltranferasa 1 y proteína 6 estimuladora de TNF en complejos cúmulo-oocito (COCs), y mejoró la producción de blastocistos (30.2% vs. 17.2%). En conclusión, la MIV con melatonina y la pre-MIV con inhibidores meióticos son métodos que pueden mejorar sustancialmente la competencia de los oocitos de hembras muy jóvenes para producir embriones in vitro.

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