Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae

[ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA si...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Zamarreño Lozano, Javier
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2025
País:España
Institución:Universidad de Salamanca (USAL)
Repositorio:GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
OAI Identifier:oai:gredos.usal.es:10366/167325
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10366/167325
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Ciclinas
ADN Replicación
ADN Síntesis
ADN Reparación
DNA Replication
DNA
Ubiquitins
Saccharomyces cerevisiae
3201.01 Oncología
ADN
ubicuitinas
replicación del ADN
id ES_005030aa905f46ef2e30d8ec0fa2d5af
oai_identifier_str oai:gredos.usal.es:10366/167325
network_acronym_str ES
network_name_str España
repository_id_str
dc.title.none.fl_str_mv Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
title Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
spellingShingle Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
Zamarreño Lozano, Javier
Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Ciclinas
ADN Replicación
ADN Síntesis
ADN Reparación
DNA Replication
DNA
Ubiquitins
Saccharomyces cerevisiae
3201.01 Oncología
Saccharomyces cerevisiae
ADN
ubicuitinas
replicación del ADN
title_short Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
title_full Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
title_fullStr Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
title_full_unstemmed Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
title_sort Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae
dc.creator.none.fl_str_mv Zamarreño Lozano, Javier
author Zamarreño Lozano, Javier
author_facet Zamarreño Lozano, Javier
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Bueno Núñez, Andrés Avelino
Sacristán Martín, María Paz
dc.subject.none.fl_str_mv Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Ciclinas
ADN Replicación
ADN Síntesis
ADN Reparación
DNA Replication
DNA
Ubiquitins
Saccharomyces cerevisiae
3201.01 Oncología
Saccharomyces cerevisiae
ADN
ubicuitinas
replicación del ADN
topic Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Ciclinas
ADN Replicación
ADN Síntesis
ADN Reparación
DNA Replication
DNA
Ubiquitins
Saccharomyces cerevisiae
3201.01 Oncología
Saccharomyces cerevisiae
ADN
ubicuitinas
replicación del ADN
description [ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA sirve como plataforma sobre la que se unen distintas proteínas para realizar sus funciones sobre el ADN, como por ejemplo las ADN polimerasas Pol ε y Pol δ. Uno de los mecanismos moleculares que permite a PCNA dirigir qué proteínas o rutas señalizadoras deben actuar es su modificación postraduccional (PTM). Particularmente relevante para este trabajo es la modificación de PCNA mediante la adición de subunidades de ubiquitina. Tradicionalmente, esta PTM ocurre cuando las polimerasas Pol ε y Pol δ se bloquean porque su centro catalítico no se puede adaptar a una lesión en el ADN. Para evitar el colapso del proceso replicativo, PCNA se ubiquitina, activando así las denominadas rutas de tolerancia al daño en el ADN (DDT, del inglés DNA Damage Tolerance). Estas vías permiten atravesar las lesiones y continuar la replicación. Sin embargo, dado que estas rutas conllevan ciertos riesgos para la integridad genómica, deben estar estrictamente reguladas. La forma de desactivarlas es mediante la eliminación de las marcas de ubiquitina en PCNA por acción de desubiquitinasas. En Saccharomyces cerevisiae, el organismo modelo de este estudio, antes de comenzar este trabajo se conocían dos desubiquitinasas de PCNA (PCNA-DUBs): Ubp10 y Ubp12. Estas proteasas colaboran regulando las rutas DDT de forma asimétrica en las dos hebras del ADN, las cuales, además, se replican mediante mecanismos distintos. La hebra líder se replica de manera continua, mientras que la hebra rezagada lo hace de forma discontinua, mediante la síntesis de millones de fragmentos cortos conocidos como Fragmentos de Okazaki, que posteriormente se procesan y unen para formar una hebra continua en un proceso denominado maduración de fragmentos de Okazaki (OFM). En este trabajo partimos de la identificación de una nueva PCNA-DUB, Ubp1. Aunque esta proteína se había descrito exclusivamente como citoplasmática, aquí identificamos una subpoblación nuclear que participa en la desubiquitinación de PCNA. Colaborando con las ya conocidas Ubp10 y Ubp12, Ubp1 contribuye a evitar la acumulación de PCNA ubiquitinado durante la replicación del ADN. La eliminación combinada de estas tres proteínas provoca la acumulación crónica de PCNA ubiquitinado incluso en condiciones no perturbadas, es decir, en ausencia de daño exógeno al ADN. En este contexto, establecemos una relación causa-efecto entre dicha acumulación crónica y un proceso replicativo lento e ineficiente. Además, demostramos que, bajo condiciones de estrés replicativo, cuanto mayor es el defecto en la desubiquitinación de PCNA debido a la ausencia de las PCNA-DUBs, mayor es la acumulación de estructuras replicativas asociadas a las rutas de tolerancia al daño, determinando una correlación directa entre ambos fenómenos.Por otro lado, este trabajo también explora el posible papel de la desubiquitinación de PCNA en la replicación de la hebra rezagada, concretamente durante la maduración de los fragmentos de Okazaki (OFM). En este contexto, demostramos que Ubp10 participa directamente en dicho proceso a través de su actividad desubiquitinadora sobre PCNA. La ausencia de Ubp10 provoca un defecto en este proceso, lo que conduce a una acumulación patológica de PCNA en la cromatina. Esta retención anómala constituye la causa última de una maduración incorrecta de los fragmentos de Okazaki, impidiendo que sean ligados en el tiempo adecuado. Determinamos que estos defectos derivados de la pérdida de Ubp10 son completamente suprimidos mediante el uso de alelos inestables de PCNA, que favorecen su descarga espontánea de la cromatina. Finalmente, concluimos que esta OFM defectiva, consecuencia directa de la falta de Ubp10, en última instancia provoca un defecto replicativo a lo largo de todo el genoma, que se manifiesta como una duplicación del ADN lenta e ineficiente.
publishDate 2025
dc.date.none.fl_str_mv 2025
2025
2025
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
dc.identifier.none.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10366/167325
url http://hdl.handle.net/10366/167325
dc.language.none.fl_str_mv Inglés
language_invalid_str_mv Inglés
dc.relation.none.fl_str_mv EDU/1508/2020
PID2019-109616GB-100
SA103P20
dc.rights.none.fl_str_mv Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
info:eu-repo/semantics/openAccess
rights_invalid_str_mv Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
eu_rights_str_mv openAccess
dc.source.none.fl_str_mv reponame:GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
instname:Universidad de Salamanca (USAL)
instname_str Universidad de Salamanca (USAL)
reponame_str GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
collection GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
repository.name.fl_str_mv
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1869402489087852544
spelling Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiaeZamarreño Lozano, JavierTesis y disertaciones académicasUniversidad de Salamanca (España)Tesis DoctoralAcademic dissertationsCiclinasADN ReplicaciónADN SíntesisADN ReparaciónDNA ReplicationDNAUbiquitinsSaccharomyces cerevisiae3201.01 OncologíaSaccharomyces cerevisiaeADNubicuitinasreplicación del ADN[ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA sirve como plataforma sobre la que se unen distintas proteínas para realizar sus funciones sobre el ADN, como por ejemplo las ADN polimerasas Pol ε y Pol δ. Uno de los mecanismos moleculares que permite a PCNA dirigir qué proteínas o rutas señalizadoras deben actuar es su modificación postraduccional (PTM). Particularmente relevante para este trabajo es la modificación de PCNA mediante la adición de subunidades de ubiquitina. Tradicionalmente, esta PTM ocurre cuando las polimerasas Pol ε y Pol δ se bloquean porque su centro catalítico no se puede adaptar a una lesión en el ADN. Para evitar el colapso del proceso replicativo, PCNA se ubiquitina, activando así las denominadas rutas de tolerancia al daño en el ADN (DDT, del inglés DNA Damage Tolerance). Estas vías permiten atravesar las lesiones y continuar la replicación. Sin embargo, dado que estas rutas conllevan ciertos riesgos para la integridad genómica, deben estar estrictamente reguladas. La forma de desactivarlas es mediante la eliminación de las marcas de ubiquitina en PCNA por acción de desubiquitinasas. En Saccharomyces cerevisiae, el organismo modelo de este estudio, antes de comenzar este trabajo se conocían dos desubiquitinasas de PCNA (PCNA-DUBs): Ubp10 y Ubp12. Estas proteasas colaboran regulando las rutas DDT de forma asimétrica en las dos hebras del ADN, las cuales, además, se replican mediante mecanismos distintos. La hebra líder se replica de manera continua, mientras que la hebra rezagada lo hace de forma discontinua, mediante la síntesis de millones de fragmentos cortos conocidos como Fragmentos de Okazaki, que posteriormente se procesan y unen para formar una hebra continua en un proceso denominado maduración de fragmentos de Okazaki (OFM). En este trabajo partimos de la identificación de una nueva PCNA-DUB, Ubp1. Aunque esta proteína se había descrito exclusivamente como citoplasmática, aquí identificamos una subpoblación nuclear que participa en la desubiquitinación de PCNA. Colaborando con las ya conocidas Ubp10 y Ubp12, Ubp1 contribuye a evitar la acumulación de PCNA ubiquitinado durante la replicación del ADN. La eliminación combinada de estas tres proteínas provoca la acumulación crónica de PCNA ubiquitinado incluso en condiciones no perturbadas, es decir, en ausencia de daño exógeno al ADN. En este contexto, establecemos una relación causa-efecto entre dicha acumulación crónica y un proceso replicativo lento e ineficiente. Además, demostramos que, bajo condiciones de estrés replicativo, cuanto mayor es el defecto en la desubiquitinación de PCNA debido a la ausencia de las PCNA-DUBs, mayor es la acumulación de estructuras replicativas asociadas a las rutas de tolerancia al daño, determinando una correlación directa entre ambos fenómenos.Por otro lado, este trabajo también explora el posible papel de la desubiquitinación de PCNA en la replicación de la hebra rezagada, concretamente durante la maduración de los fragmentos de Okazaki (OFM). En este contexto, demostramos que Ubp10 participa directamente en dicho proceso a través de su actividad desubiquitinadora sobre PCNA. La ausencia de Ubp10 provoca un defecto en este proceso, lo que conduce a una acumulación patológica de PCNA en la cromatina. Esta retención anómala constituye la causa última de una maduración incorrecta de los fragmentos de Okazaki, impidiendo que sean ligados en el tiempo adecuado. Determinamos que estos defectos derivados de la pérdida de Ubp10 son completamente suprimidos mediante el uso de alelos inestables de PCNA, que favorecen su descarga espontánea de la cromatina. Finalmente, concluimos que esta OFM defectiva, consecuencia directa de la falta de Ubp10, en última instancia provoca un defecto replicativo a lo largo de todo el genoma, que se manifiesta como una duplicación del ADN lenta e ineficiente.[EN] PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) is an essential protein highly conserved throughout evolution, from bacteria to mammals. PCNA acts as a sliding clamp that encircles DNA, coordinating numerous processes involved in DNA replication and repair. It functions as a platform that recruits and organizes numerous protein partners, such as DNA polymerases Pol ε and Pol δ, to carry out their functions on the genome. One of the key molecular mechanisms through which PCNA directs protein recruitment and pathway choice is its post-translational modification (PTM). Particularly relevant to this work is the ubiquitylation of PCNA, which typically occurs when DNA polymerases are stalled due to DNA lesions that block their catalytic activity. In response, PCNA becomes ubiquitylated, triggering the DNA damage tolerance (DDT) pathways, allowing replication to bypass DNA lesions. However, because these pathways carry inherent risks for genomic instability, they must be tightly regulated. Their timely inactivation depends on the removal of ubiquitin moieties from PCNA by specific deubiquitylating enzymes. In Saccharomyces cerevisiae, the model organism used in this study, two PCNA-specific deubiquitylases (PCNA-DUBs) have been characterized to date: Ubp10 and Ubp12. These two PCNA-DUBs regulate DDT asymmetrically on the two DNA strands, which are replicated through distinct mechanisms. While the leading strand is synthesized continuously, the lagging strand is replicated discontinuously through the synthesis of millions of short DNA segments known as Okazaki fragments. These are later processed and ligated into a continuous strand during the Okazaki Fragment Maturation (OFM) process. In this work, we identify and characterize a novel PCNA-DUB, Ubp1. Previously reported as an exclusively cytoplasmic protein, we now demonstrate the existence of a nuclear subpopulation of Ubp1 that participates in PCNA deubiquitylation. Collaborating with Ubp10 and Ubp12, Ubp1 contributes to the prevention of PCNA ubiquitylation accumulation during DNA replication. Combined deletion of these three PCNA-DUBs leads to chronic accumulation of PCNA-K164 ubiquitylation even under unperturbed conditions, in the absence of exogenous DNA damage. We establish a direct causal link between this persistent ubiquitylation and delayed defective DNA replication. Moreover, we demonstrate that under replication stress, the greater the defect in PCNA deubiquitylation due to the absence of PCNA-DUBs, the higher the accumulation of replication intermediates associated with DNA damage tolerance pathways, revealing a direct correlation between them. Furthermore, this study also explores a role for PCNA deubiquitylation in lagging-strand replication, specifically during OFM. We show that Ubp10 directly participates in this process through its PCNA deubiquitylation activity. Loss of Ubp10 results in defective deubiquitylation, leading to pathological retention of PCNA on chromatin. This unscheduled retention disrupts timely OFM, preventing proper ligation of Okazaki fragments. We demonstrate that defects arising from Ubp10 loss are fully suppressed by disassembly-prone PCNA mutants, which promote spontaneous PCNA unloading from chromatin. Ultimately, we conclude that defective OFM due to Ubp10 depletion leads to a genome-wide replication defect, manifested as slow and inefficient DNA synthesis.Javier Zamarreño Lozano ha realizado este trabajo de tesis doctoral siendo beneficiario de un contrato predoctoral de la Junta de Castilla y León cofinanciado por el Fondo Social Europeo Orden EDU/1508/2020 desde el 18 de julio de 2021 hasta el 18 de julio de 2025. El doctorando realizó parte del presente trabajo durante una estancia de investigación de tres meses de duración, entre el 14 de septiembre y diciembre de 2024, en el laboratorio del profesor Duncan Smith, en la Universidad de Nueva York (NYU) en Nueva York, Estados Unidos. Esta estancia fue financiada mediante el programa de ayudas a la movilidad internacional de la escuela de doctorado de la Universidad de Salamanca 2024. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovacion y Universidades mediante el proyecto PID2019-109616GB-100 y por programa de la Junta de Castilla y León de apoyo a proyectos de investigación, cofinanciadas por el Fondo Europeo mediante el proyecto SA103P20.Bueno Núñez, Andrés AvelinoSacristán Martín, María Paz202520252025info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://hdl.handle.net/10366/167325reponame:GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamancainstname:Universidad de Salamanca (USAL)InglésEDU/1508/2020PID2019-109616GB-100SA103P20Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessoai:gredos.usal.es:10366/1673252026-06-07T06:28:51Z
score 15.812429

Similares en LA Referencia