Functional Analysis of PCNA Deubiquitylation in Replication Fork Dynamics and Okazaki Fragment Maturation in Saccharomyces cerevisiae

[ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA si...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Zamarreño Lozano, Javier
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2025
País:España
Institución:Universidad de Salamanca (USAL)
Repositorio:GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
OAI Identifier:oai:gredos.usal.es:10366/167325
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10366/167325
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Tesis y disertaciones académicas
Universidad de Salamanca (España)
Tesis Doctoral
Academic dissertations
Ciclinas
ADN Replicación
ADN Síntesis
ADN Reparación
DNA Replication
DNA
Ubiquitins
Saccharomyces cerevisiae
3201.01 Oncología
ADN
ubicuitinas
replicación del ADN
Descripción
Sumario:[ES] PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación) es una proteína esencial, altamente conservada a lo largo de la evolución, desde bacterias hasta mamíferos. Esta molécula, que actúa abrazando al ADN, orquesta numerosos procesos relacionados con la replicación y reparación del genoma. PCNA sirve como plataforma sobre la que se unen distintas proteínas para realizar sus funciones sobre el ADN, como por ejemplo las ADN polimerasas Pol ε y Pol δ. Uno de los mecanismos moleculares que permite a PCNA dirigir qué proteínas o rutas señalizadoras deben actuar es su modificación postraduccional (PTM). Particularmente relevante para este trabajo es la modificación de PCNA mediante la adición de subunidades de ubiquitina. Tradicionalmente, esta PTM ocurre cuando las polimerasas Pol ε y Pol δ se bloquean porque su centro catalítico no se puede adaptar a una lesión en el ADN. Para evitar el colapso del proceso replicativo, PCNA se ubiquitina, activando así las denominadas rutas de tolerancia al daño en el ADN (DDT, del inglés DNA Damage Tolerance). Estas vías permiten atravesar las lesiones y continuar la replicación. Sin embargo, dado que estas rutas conllevan ciertos riesgos para la integridad genómica, deben estar estrictamente reguladas. La forma de desactivarlas es mediante la eliminación de las marcas de ubiquitina en PCNA por acción de desubiquitinasas. En Saccharomyces cerevisiae, el organismo modelo de este estudio, antes de comenzar este trabajo se conocían dos desubiquitinasas de PCNA (PCNA-DUBs): Ubp10 y Ubp12. Estas proteasas colaboran regulando las rutas DDT de forma asimétrica en las dos hebras del ADN, las cuales, además, se replican mediante mecanismos distintos. La hebra líder se replica de manera continua, mientras que la hebra rezagada lo hace de forma discontinua, mediante la síntesis de millones de fragmentos cortos conocidos como Fragmentos de Okazaki, que posteriormente se procesan y unen para formar una hebra continua en un proceso denominado maduración de fragmentos de Okazaki (OFM). En este trabajo partimos de la identificación de una nueva PCNA-DUB, Ubp1. Aunque esta proteína se había descrito exclusivamente como citoplasmática, aquí identificamos una subpoblación nuclear que participa en la desubiquitinación de PCNA. Colaborando con las ya conocidas Ubp10 y Ubp12, Ubp1 contribuye a evitar la acumulación de PCNA ubiquitinado durante la replicación del ADN. La eliminación combinada de estas tres proteínas provoca la acumulación crónica de PCNA ubiquitinado incluso en condiciones no perturbadas, es decir, en ausencia de daño exógeno al ADN. En este contexto, establecemos una relación causa-efecto entre dicha acumulación crónica y un proceso replicativo lento e ineficiente. Además, demostramos que, bajo condiciones de estrés replicativo, cuanto mayor es el defecto en la desubiquitinación de PCNA debido a la ausencia de las PCNA-DUBs, mayor es la acumulación de estructuras replicativas asociadas a las rutas de tolerancia al daño, determinando una correlación directa entre ambos fenómenos.Por otro lado, este trabajo también explora el posible papel de la desubiquitinación de PCNA en la replicación de la hebra rezagada, concretamente durante la maduración de los fragmentos de Okazaki (OFM). En este contexto, demostramos que Ubp10 participa directamente en dicho proceso a través de su actividad desubiquitinadora sobre PCNA. La ausencia de Ubp10 provoca un defecto en este proceso, lo que conduce a una acumulación patológica de PCNA en la cromatina. Esta retención anómala constituye la causa última de una maduración incorrecta de los fragmentos de Okazaki, impidiendo que sean ligados en el tiempo adecuado. Determinamos que estos defectos derivados de la pérdida de Ubp10 son completamente suprimidos mediante el uso de alelos inestables de PCNA, que favorecen su descarga espontánea de la cromatina. Finalmente, concluimos que esta OFM defectiva, consecuencia directa de la falta de Ubp10, en última instancia provoca un defecto replicativo a lo largo de todo el genoma, que se manifiesta como una duplicación del ADN lenta e ineficiente.

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