Expresión heteróloga y caracterización de una xilanasa activa en frío proveniente de una cepa de Cladosporium sp. de origen antártico

Las endoxilanasas provenientes de hongos filamentosos mesófilos son enzimas de interés biotecnológico que han sido ampliamente aisladas y caracterizadas. Por el contrario, las endoxilanasas de hongos provenientes de ambientes fríos, como el continente Antártico, han sido menos estudiadas. En esta Te...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor: Gil-Durán, Carlos Andrés
Tipo de recurso: tesis doctoral
Estado:Versión publicada
Fecha de publicación:2018
País:Chile
OAI Identifier:oai:repositorio.anid.cl:10533/232917
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/10533/232917
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Palabra clave:Ciencias Naturales
Otras Ciencias Naturales
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description Las endoxilanasas provenientes de hongos filamentosos mesófilos son enzimas de interés biotecnológico que han sido ampliamente aisladas y caracterizadas. Por el contrario, las endoxilanasas de hongos provenientes de ambientes fríos, como el continente Antártico, han sido menos estudiadas. En esta Tesis se realizó la identificación de Cladosporium spongiae, nueva especie de hongo filamentoso aislado de la Antártica, la caracterización de una endoxilanasa activa en frío (XynA) proveniente de este hongo, y la caracterización de una versión mutada de la enzima (XynAΔ29N). Además, se evaluó el potencial de estas enzimas en el proceso de panificación. XynA fue producida y purificada desde Pichia pastoris, y presentó actividad óptima a 50 °C. Además, esta enzima mostró baja termostabilidad, ya que después de 20 min de incubación a 40ºC pierde su actividad. XynA es una endoxilanasa clásica, con alta actividad frente a arabinoxilanos, liberando xilooligosacáridos como producto. Esta proteína tiene una estructura terciaria tipo barril α8 / β8 y un extremo N-terminal formado por aminoácidos descritos como "no estructurales". Para evaluar el efecto de esta región sobre la actividad enzimática, se construyó un mutante eliminando el extremo N-terminal (XynAΔ29N). XynAΔ29N mostró actividad óptima a 45 °C, sin embargo, la termoestabilidad de esta enzima es mayor, reteniendo el 100% de actividad luego de incubación por 60 min a 40 °C. En relación con su capacidad de degradar xilanos, XynAΔ29N mostró mayor actividad específica en comparación a XynA, y además de producir xilooligosacáridos, generó xilosa como producto. Sorprendentemente, XynAΔ29N tuvo actividad sobre p-nitrofenil-beta-D-xilopiranósido (pNPxyl), sugiriendo que la enzima mutante tiene dos actividades (endoxilanasa/xilohidrolasa), característica ausente en XynA. Finalmente, ambas enzimas fueron utilizadas en la elaboración de pan, comparando su desempeño con una endoxilanasa comercial. Tanto XynA como XynAΔ29N disminuyeron la tenacidad de la masa aumentaron su elasticidad y el volumen específico del pan. La caracterización de esta enzima activa en frío y su versión mutante abre perspectivas novedosas y prometedoras para su aplicación biotecnológica.
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En esta Tesis se realizó la identificación de Cladosporium spongiae, nueva especie de hongo filamentoso aislado de la Antártica, la caracterización de una endoxilanasa activa en frío (XynA) proveniente de este hongo, y la caracterización de una versión mutada de la enzima (XynAΔ29N). Además, se evaluó el potencial de estas enzimas en el proceso de panificación. XynA fue producida y purificada desde Pichia pastoris, y presentó actividad óptima a 50 °C. Además, esta enzima mostró baja termostabilidad, ya que después de 20 min de incubación a 40ºC pierde su actividad. XynA es una endoxilanasa clásica, con alta actividad frente a arabinoxilanos, liberando xilooligosacáridos como producto. Esta proteína tiene una estructura terciaria tipo barril α8 / β8 y un extremo N-terminal formado por aminoácidos descritos como "no estructurales". Para evaluar el efecto de esta región sobre la actividad enzimática, se construyó un mutante eliminando el extremo N-terminal (XynAΔ29N). XynAΔ29N mostró actividad óptima a 45 °C, sin embargo, la termoestabilidad de esta enzima es mayor, reteniendo el 100% de actividad luego de incubación por 60 min a 40 °C. En relación con su capacidad de degradar xilanos, XynAΔ29N mostró mayor actividad específica en comparación a XynA, y además de producir xilooligosacáridos, generó xilosa como producto. Sorprendentemente, XynAΔ29N tuvo actividad sobre p-nitrofenil-beta-D-xilopiranósido (pNPxyl), sugiriendo que la enzima mutante tiene dos actividades (endoxilanasa/xilohidrolasa), característica ausente en XynA. Finalmente, ambas enzimas fueron utilizadas en la elaboración de pan, comparando su desempeño con una endoxilanasa comercial. Tanto XynA como XynAΔ29N disminuyeron la tenacidad de la masa aumentaron su elasticidad y el volumen específico del pan. La caracterización de esta enzima activa en frío y su versión mutante abre perspectivas novedosas y prometedoras para su aplicación biotecnológica.Endoxylanases from mesophilic filamentous fungi are enzymes of biotechnological interest that have been widely isolated and characterized. However, endoxylanases from cold-adapted fungi from environments such as Antarctica have been less studied. This Thesis reports the identification of Cladosporium spongiae, a new species of filamentous fungus isolated from Antarctica, the characterization of a cold-active endoxylanase (XynA) from this fungus and the characterization of a mutant version of the enzyme (XynAΔ29N). In addition, the potential of these enzymes in baking was evaluated. XynA was produced and purified from Pichia pastoris. It presented optimal activity at 50 ° C, but it showed low thermostability. XynA lost its activity after 20 min of incubation at 40ºC. XynA is a classical endoxylanase, showing high activity towards arabinoxylans, and releasing xylooligosaccharides as a product. This protein has a α8 / β8 barrel structure and an N-terminal end formed by amino acids described as "non-structural". To evaluate the effect of this region on enzymatic activity, it was removed. The mutant enzyme lacking N-terminal end (XynAΔ29N) showed optimal activity at 45 °C; however, its thermostability was higher than XynA, retaining 100% activity after 60 min at 40 ° C. Regarding its ability to degrade xylans, XynAΔ29N showed higher specific activity as compared to XynA. In addition, XynAΔ29N released xylooligosaccharides and xylose as products. Surprisingly, XynAΔ29N was active on p-nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside (pNPxyl), suggesting that in constrast to XynA, XynAΔ29N has two activities (endoxylanase / xylohydrolase). Finally, both enzymes were used in bread making, comparing their performance with a commercial endoxylanase. Both XynA and XynAΔ29N decreased the tenacity of the dough, increased its elasticity and the specific volume of bread. The characterization of the cold-activated enzyme and its mutant version opens new and promising perspectives for their biotechnological application.PFCHA-BecasLo resultados de esta tesis se están utilizando para una patente presentada ya en el INAPIPFCHA-Becas63140056https://hdl.handle.net/10533/232917instname: Conicytreponame: Repositorio Digital RI2.0info:eu-repo/grantAgreement//63140056info:eu-repo/grantAgreement//Folio 63140056info:eu-repo/grantAgreement//63140056info:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/Ciencias NaturalesOtras Ciencias NaturalesExpresión heteróloga y caracterización de una xilanasa activa en frío proveniente de una cepa de Cladosporium sp. de origen antárticoHeterologous expression and characterization of a cold active xylanase from a strain of Cladosporium sp. of Antarctic originTesis Doctoradoinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionTesisTesishttps://hdl.handle.net/10533/232917PFCHA-Becas63cdef9e-46fa-4887-86a3-8259febbb0f5virtual::48437-163cdef9e-46fa-4887-86a3-8259febbb0f5virtual::48437-1ORIGINALGil_Duran_Carlos_Andres.pdfPdf del documento de Tesisapplication/pdf4183986https://repositorio.anid.cl/bitstreams/7c3fe30a-51c7-45ac-bd3f-8f02ef222d1f/download875cbfd8c7482ab2cc3a9fb0134b81c6MD51CC-LICENSElicense_rdfapplication/octet-stream1232https://repositorio.anid.cl/bitstreams/797f7d91-84c1-4293-8591-465c918d1563/downloadf97bcfdf58f3e17b5cec231112dab5b1MD52LICENSElicense.txttext/plain1779https://repositorio.anid.cl/bitstreams/18825f19-5ab7-4933-871d-a5a3a3a9854c/download593a6e7305c66c56041a9f9e15a649c1MD53TEXTGil_Duran_Carlos_Andres.pdf.txtExtracted texttext/plain267288https://repositorio.anid.cl/bitstreams/52627337-cc6c-430f-ae7d-098561aee6cc/downloadd353c17f8b4580695b532389153b7c1cMD54THUMBNAILGil_Duran_Carlos_Andres.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg1420https://repositorio.anid.cl/bitstreams/9b07bf64-3cf9-43e2-9022-055d1a3ad8c0/download3eeba94d1fbd48e70065f5f2cfcf73e5MD5510533/232917oai:repositorio.anid.cl:10533/2329172023-07-24 17:33:47.318http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/info:eu-repo/semantics/embargoedAccesshttps://repositorio.anid.clRepositorio ANIDaletelier@anid.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